陈营营,毛瑞峰

(淮阴师范学院 生命科学学院,江苏 淮安 223300)

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是一类异质性革兰氏阳性菌,它们的使用历史悠久,被认为是安全的,其中一些物种具有对人类健康有益的影响,因此被用作益生菌。此外,在描述其特征时,LAB通常被声称具有“公认安全”(Generally Recognized as Safe,GRAS)状态,这也证明了其安全性[1]。然而,尽管一些LAB物种对人类无害,但从监管的角度来看,并非所有LAB都可以被描述为GRAS。美国食品药品监督管理局(FDA)负责GRAS状态批准,因此要求在授予特定菌株GRAS状态之前评估其安全性。迄今为止,只有非基因修饰(非转基因)的乳酸菌菌株获得了美国食品药品监督管理局的批准。

LAB的基因工程提供了各种工具来改进菌株,提高其生存能力和稳定性,提高产量和生长速度。有效表达治疗蛋白和将LAB用作疫苗的可能性进一步加强了其潜在用途[2]。然而,无论一种特定的转基因LAB可能有多有效,阻碍其营销的一个缺点是它受到了基因操纵;这主要是由于消费者对转基因微生物的接受度低(特别是在欧盟)以及对其使用的监管限制。在2018年国际益生菌协会世界大会上,有人指出,从科学角度来看,转基因益生菌是完美的,在欧洲食品安全局注册时可能不会遇到问题。然而,消费者和工业界对转基因生物的差异阻碍了它们的接受,因此,只有天然产生的菌株才能获得批准。 本文讨论了将基因工程LAB推向市场时可能遇到的障碍,以及它们获得更好接受所需的步骤。

1 GRAS状态:定义与确定

GRAS状态表明,当一种物质被添加到食品中时,美国食品药品监督管理局认为它是安全的。美国食品药品监督管理局可以将微生物及其衍生物归类为批准用于特定用途的食品添加剂,也可以将其归类为GRAS物质。自1997年以来,一种物质被认为是GRAS,如果:1)1958年之前在食品中使用过(即,GRAS状态是基于在食品中安全使用的历史,要求大量消费者有大量的食品消费史);或2)已采取科学程序,要求与满足食品添加剂法规所需的证据数量和质量相同。GRAS物质和食品添加剂是根据评估专家来区分的。对于食品添加剂,美国食品药品监督管理局确定该成分的安全性,而对于GRAS物质,可以由美国食品药品管理局以外的合格专家进行确定。

鉴于GRAS状态适用于美国和欧洲的监管框架,欧洲食品安全局使用合格安全假设程序来评估含有微生物的产品,并评估与人类、动物和环境使用相关的风险[3]。关于欧洲监管框架和合格安全假设程序所需的步骤,请参阅参考文献[4],其中提供了详细描述。

2 基因修饰的后果

LAB的基因组修饰可以导致细胞功能的失活或引入新功能。为了实现功能的失活,可以删除或突变基因以削弱其功能。约翰逊乳杆菌具有三个活性胆汁盐水解酶(bsh)基因,可以在小鼠肠道中持续存在;另一方面,瑞士乳杆菌不能持续存在,因为它的bsh基因发生了框架移位,导致其失活[5]。该领域的发展带来了新的技术,现在可以精确去除或替换遗传元素,并且已经成功应用于LAB[6],通常目的是实现生物防护,避免不需要的遗传元素传播到环境中。当引入新功能时,可以通过启动子的突变(例如,允许或增加蛋白质表达)或通过逐点突变改变基因(例如,增加酶的催化活性)来激活基因[7]。还可以通过新基因的稳定基因组整合来引入新功能。

3 关于转基因乳酸菌的主要问题及其解决方案

从监管立法角度和消费者角度来看,基因改造本身都被认为是有问题的。到目前为止,还没有一种转基因LAB菌株被推向市场用于治疗或作为食品补充剂。相反,该行业专注于避免使用重组DNA技术,而是应用了自发诱变。

3.1 生物防护

生物防护是一种策略,用于防止遗传物质向其他细菌的横向传播和工程菌株的环境传播,以及随后在环境中的积累。任何突变体逃逸的频率必须足够低,以确保突变体不可能存活。生物防护系统可以是主动的,也可以是被动的。主动遏制系统能够通过激活杀死基因或抑制必需基因来杀死宿主,该基因的表达受到环境响应元件的严格控制[8]。然而,可能发生使杀伤基因失活或导致必需基因组成型表达的突变。此外,在主动系统中,引入的外源DNA的量通常大于被动系统中的外源DNA。活性系统通常依赖于质粒,质粒需要整合到细菌染色体中。随后,在质粒整合到细菌染色体中之后,需要证明LAB的功能。另一方面,被动遏制系统是稳健的,设计非常简单,它们主要基于通过补充环境中通常不存在的另一种基因或必需代谢产物来补充营养缺陷或基因缺陷。被动系统的主要缺点是它们通常是抑菌的,而不是杀菌的。然而,杀菌作用可以通过两种营养缺陷型营养因子的组合获得[8]。

新的生物防护策略使用合成基因回路来控制细胞增殖,以应对环境条件,这是由变构调节的转录因子检测到的[9]。为了开发合成营养缺陷型,在大肠杆菌中构建了依赖于外源合成小分子表达必需基因的菌株。生物防护系统包含重叠的保障措施:用于控制基本基因表达的工程核糖调节剂;以及基于切割宿主基因组的核酸酶的工程成瘾模块[10]。这些新的生物防护策略可以从大肠杆菌转移到LAB。

3.2 乳酸菌的抗生素耐药性及其在筛选转基因生物中的应用

抗生素耐药性涉及活性抗生素分子直接失活的几种机制,以及通过改变靶位点或减少抗生素摄取而丧失对抗生素的易感性的几种机制。频繁使用抗生素会导致耐药细菌微生物将其耐药机制转移到其他微生物身上,并对公共健康和环境构成威胁。因此,2017年,世界卫生组织发起了一项运动,作为全球计划的一部分,提高人们对抗生素耐药性(包括抗生素耐药性)的认识[11]。

乳酸菌可能是抗生素耐药性基因的宿主。抗性基因转移是垂直的,因此它本身并不存在安全问题。然而,外部因素可以诱导有利于通过食物链水平转移对病原体的抗性基因的变化,这是人类和动物健康关注的一个主要原因。LAB的安全性研究表明,它们很容易对抗生素产生耐药性。大多数可用数据都是从机会致病性肠球菌中收集的,尤其是耐万古霉素的肠球菌,它会导致反复的医院获得性感染[12]。对于摄入益生菌后人类消化道中抗生素耐药性基因转移的风险,应考虑向免疫受损的患者添加益生菌乳酸杆菌。

3.3 无抗生素选择系统

目前,已经开发了不含抗生素耐药性基因的表达和基因递送载体来提高产品的安全性。根据其作用机制,这些系统可以基于营养缺陷型、非抗生素显性和互补标记、分离后杀伤、RNA干扰或对必需基因的去抑制[13]。非抗生素显性选择标记是直接的,并且取决于它们在感兴趣的质粒中的存在。显性选择标记的例子取决于细菌素抗性或重金属抗性[14]。细菌素的一个典型代表是乳链菌素,它是由某些乳酸乳杆菌菌株产生的,在食品工业中被广泛用作一种安全天然的防腐剂。基于细菌素抗性的第一个食品级质粒含有乳酸链球菌素抗性基因[15]。

3.4 毒力因素

每种生物工程菌株都需要仔细评估毒力因素,即可能引起致病性的基因。外源DNA的引入可能导致新物质的合成,如蛋白质或代谢产物,这些物质也可能具有毒性或致敏性。对于新的蛋白质,必须将氨基酸序列与已知蛋白质进行比较,以获得潜在的同源性。它们的抗营养活性(例如,作为蛋白酶抑制剂、凝集素)以及对加热、加工和降解的稳定性必须在适当的代表性胃和肠模型系统中进行评估。到目前为止,还没有关于这种新表达的蛋白质预测人类过敏反应的有限测试报告[16]。

3.5 延迟的不良影响

产品的安全性和个人对产品的反应取决于其应用模式(例如局部、系统)和消费者的基因档案。特定亚群体可能特别敏感,如免疫受损的个体、婴儿和老年人。因此,必须对新型食品进行上市后监测,以避免潜在的严重不良影响。在任何此类新型食品投放市场后,需要对其对消费者的影响进行长期监测。由于摄入不一致导致的技术问题可能是一个缺点,并且可能难以长期监测变化[16]。在转基因LAB投放市场后,建议对其进行密切监测,以防止延迟的不良影响,并确保安全消费。

3.6 表面展示

重组蛋白与未分化细菌表面的异源结合将使非转基因和不太复杂的调控程序得以使用[17];然而,需要确认缺乏重组DNA和活的重组细菌细胞。已经在LAB中成功开发了几种异源蛋白质展示系统。与GFP融合并在大肠杆菌中表达的内溶素Lyb5附着在各种LAB的表面,包括乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌[18]。此外,与AcmA融合的“设计锚蛋白重复蛋白”已显示出与嗜酸乳杆菌表面的异源结合。源于活性LAB的细菌样颗粒同样可以作为表面展示的载体,通过利用大肠杆菌等异源表达体系,获得含有锚定域的融合重组蛋白,再通过与LAB细菌样颗粒混合,可实现将目的蛋白质展示于细菌样颗粒表面,进而获得颗粒型疫苗等制剂,从而可避免转基因组分的使用[19]。

4 将LAB作为细胞工厂进行基因改造

经过基因改造的LAB可以在封闭系统中作为细胞工厂生产所需的化合物,这降低了微生物不必要地释放到环境中的可能性和污染风险。因此,从监管的角度来看,此类应用的问题要小得多。LAB的基因工程使其能够应用于重组蛋白的表达。这里使用的最常见的属是乳球菌属和乳杆菌属。LAB的代谢工程允许修改现有的代谢途径,以改善LAB作为食品发酵起始物的特性。不同的代谢工程策略已被用于改变生产甜味剂、风味、香气、胞外多糖和维生素的代谢途径[20]。LAB的主要工业应用是发酵生产乳酸,乳酸也是其碳水化合物代谢的主要产物。乳酸在食品、化妆品、制药、化工和农业中的应用历史悠久。此外,由于乳酸被用作生产可生物降解和生物相容性聚乳酸的前体,对乳酸的需求正在增长,在纤维、纺织、塑化和包装行业具有商业价值。感兴趣的化合物的内在生产是优选的,但这通常会导致数量不足。基因修饰提供了提高感兴趣化合物产量以及提高化合物特性(例如纯度)的可能性。除了乳酸的生产外,LAB还在非食品(如乙醇生产)和功能成分(如维生素、低热量甜味剂、胞外多糖和抗菌剂)的工业生产中发挥作用。代谢工程乳杆菌已用于从乳制品和玉米加工废料中进行乙醇的工业生物转化[21]。乳酸菌可用于生产营养品,如多元醇(如糖醇)和维生素,尤其是B族维生素,如核糖和叶酸。

5 结语

LAB的基因修饰可以产生具有广泛应用的改良菌株,包括用于治疗、食品工业和代谢产物生产(例如作为生物催化剂、细胞工厂)。这些应用程序在所需监管程序的可接受性和严格性方面存在差异。作为生物催化剂,LAB可用于生产乳酸、医药中间体、营养品和一系列化学品。它们代表了重组蛋白生产和随后分离的有前景的细胞工厂,因为它们形成包涵体的趋势很低,并且缺乏内毒素。如果不涉及基因工程,则通过过表达所需蛋白质来改善LAB作为细胞工厂是更可接受的。转基因LAB在食品制造中的使用是最有问题的,因为人们担心改良的染色剂、质粒和重组基因的传播,尤其是公众接受度低。为了使转基因LAB在食品工业中的实施成为可能,已经开发了食品级表达系统,其确保用替代标记物和同源DNA的使用来取代抗生素耐药性标记物。然而,用于食品的菌株开发仍然依赖于经典的非转基因方法。鉴于公众对转基因LAB安全性方面的担忧,相关新型研究工具应当进一步优化与完善,尽可能规避或降低出现意外风险的可能性,进而提高公众对其的认知和接受能力。