丁云录，唐皓洁，吕喜月，李晓兵，刘迎辉

（长春中医药大学，长春 130117）

本实验通过建立大鼠MIRI模型进行动物药效学实验研究，验证宣痹通瘀胶囊是否通过减轻心肌细胞线粒体损伤，从而抑制心肌细胞凋亡，达到防治心肌缺血再灌注损伤的作用。通过此实验研究为进一步明确药物的作用靶点，为中医药理论体系下的“精准医学”奠定基础，同时也为中医药防治心肌缺血再灌注损伤奠定理论基础，为新药研究提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级SD大鼠，体质量250～270 g，雌雄兼用，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，SCXK-（吉）2020-0001。宣痹通瘀胶囊，内容物为深褐色颗粒，由长春中医药大学实验研究中心提供（批次：20190920）。LY294002，规格：每支5 mg，批号：20211207，江苏凯基生物技术股份有限公司。通心络胶囊，规格：每粒0.26 g，批号：A2111013，石家庄以岭药业股份有限公司。异氟烷，规格：每瓶100 mL，产品批号：19122503，瑞沃德生命科技有限公 司。CK-MB试 剂 盒（10 mL×10支，210061）、LDH-L试剂盒（10 mL×10支，210051），中生北控生物科技股份有限公司；MDA试剂盒（每盒50 T，20210925）、SOD试剂盒（每盒50 T，20211019），南京建成生物工程研究所。cTnI检测试剂盒，规格：每盒96 T，Lot：11/2021，Exp：04/2021，黄石研科生物科技有限公司。Powerlab/8s数据分析仪（澳大利亚埃德公司）。BIO680酶标仪，BIO-RAD（伯乐）公司产品。ⅤMR动物麻醉机：型号：Matrx ⅤIP3000系列，美国MIDMARK。BI-2000医学图象分析仪，成都泰盟科技有限公司。selectra junior全自动分析仪，荷兰威图公司；Biofuge Stratos高速冷冻离心机，德国贺利氏公司；IX71倒置荧光显微镜，日本OLYMPUS。

1.2 实验方法[1-6]

1.2.1 分组给药 大鼠适应环境结束后，随机分为5个实验组：假手术组、模型组、宣痹通瘀胶囊组（前期实验已证明其最佳药效剂量为3.2 g/kg）、宣痹通瘀+LY294002组（PI3K/AKT通路抑制剂，简称LY）以及通心络胶囊阳性对照组。每组10只大鼠。用0.5%CMC-Na将宣痹通瘀胶囊、通心络胶囊配制成混悬液。假手术组与模型组动物均给予等体积（10 mL/kg/次）0.5%CMC-Na悬液。宣痹通瘀胶囊+LY组除按照宣痹通瘀胶囊组给药浓度和剂量灌胃给药以外，每日1次，皮下注射PI3K/Akt抑制剂 LY294002，10 mg/kg/d。（1 mg LY294002：1.171 mL DMSO）。各组动物每日给药1次，连续2周。

1.2.2 模型制备 末次给药后，ⅤMR动物麻醉机麻醉大鼠，左侧3～4肋间开胸，露出心脏，找到冠状动脉左前下降支（位于肺动脉圆锥和左心房之间），用0号丝线距离其根部2～3 mm 处穿出立即结扎，结扎时用一细小乳胶管垫于结扎线与血管之间，将心脏送回至胸腔，挤出胸腔内气体与血液，迅速闭合胸腔，胸腔打开时间应该不超过30 s。假手术组仅穿线不结扎。结扎缺血30 min后，松解结扎线进行再灌注，再灌注2 h，收集相关试验数据。

1.2.3 检测指标 1）心脏功能测定：连接生物信号采集系统 PowerLab、压力换能器及聚乙烯导管，分离大鼠右颈总动脉，监测大鼠LⅤSP、LⅤEDP、±dp/dtmax。2）心肌相关酶学及抗氧化指标：按试剂盒说明书要求测定血清CK-MB、LDH、SOD、cTnⅠ活性以及MDA含量。3）NBT染色法检测心肌梗死面积：心肌梗死面积=未染色心肌面积和/心肌切片总面积和×100%。4）心肌细胞凋亡指数（TUNEL法）检测：统计心肌细胞总数和凋亡细胞数，细胞凋亡率=阳性细胞/总细胞数×100%。

1.3 统计学方法 试验数据采用组间t检验进行统计学处理。

2 结果

2.1 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心脏功能的影响 宣痹通瘀、宣痹通瘀+LY、通心络组与模型组比较，均可明显升高LⅤSP、+dp/dtmax（P＜0.05或P＜0.01）；宣痹通瘀+LY组可明显降低LⅤEDP（P＜0.05），见表1。

表1 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心脏功能的影响（，n =10）

表1 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心脏功能的影响（，n =10）

注：与模型组比较，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.2 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响 宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg剂量组及宣痹通瘀胶囊

3.2 g/kg+LY10 mg/kg剂量组动物的心肌梗死面积分别与模型组比较，均明显低于模型对照组（P＜0.01），见表2。

2.3 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心肌细胞凋亡率的影响 宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg剂量及宣痹通瘀胶囊

3.2 g/kg+LY10 mg/kg剂量药物干预后，与模型组大鼠比较，心肌细胞凋亡率均有明显降低（为P＜0.01和P＜0.05），见表2。

表2 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积百分比的影响（，n =10）

表2 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积百分比的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.4 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清相关酶学指标的影响 与 MIRI模型组比较，宣痹通瘀胶囊3.2g/kg与宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg+LY10 mg/kg剂量组大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnI 含量显著降低（P＜0.01或P＜0.05），见表3。

表3 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清相关酶学指标的影响（，n =10）

表3 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清相关酶学指标的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.5 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响 宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg剂量组、宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg+LY10 mg/kg剂量组、阳性对照药通心络胶囊组动物血清中MDA含量明显低于模型组（为P＜0.01或P＜0.05）；而SOD活性却明显高于模型组（分别为P＜0.01或P＜0.05）。并且宣痹通瘀胶囊3.2g/kg+LY10 mg/kg剂量组升高动物血清SOD活性优于通心络胶囊0.56 g/kg剂量组；降低MDA含量的作用明显优于宣痹通瘀胶囊3.2 g/kg剂量组，见表4。

表4 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响（，n =10）

表4 宣痹通瘀胶囊对MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响（，n =10）

注：与模型对照组比较，# P＜0.05；△△P＜0.01；与宣痹通瘀+LY组比较，△P＜0.05

3 讨论

心肌缺血/再灌注损伤（MIRI），是一个复杂的病理生理过程，重者可致心肌微血管受损及不可逆的细胞坏死和凋亡等[7-8]。MIRI发生后，心肌细胞缺血性坏死，细胞结构严重受损，线粒体通透性改变，氧自由基增加，内皮细胞膜受到损伤，导致大量心肌酶学指标从心肌细胞中释放入血，故其含量显著增高，因此检测心肌酶学指标对急性心血管事件的诊断具有重要意义。MIRI引起的乳酸、一氧化氮堆积等均会加速正常细胞的凋亡[9-11]；心肌细胞中重要的调节蛋白cTnI是心肌损伤坏死的标志物，心肌受损程度与其升高水平相关[12-15]；CK-MB主要留存于心肌中，心肌细胞受损后，其在血清中特异性及灵敏度较高，可作为再灌注损伤的血清标志物之一[16-18]；LDH广泛存在于全身组织细胞的胞浆线粒体中，当心肌损伤时，其血清浓度也相应升高。因此 CK-MB、cTnT、LDH这三种指标均可作为心肌损伤指标；另外相关资料反映冠心病患者心肌缺血、缺氧程度的重要标志之一，为血清中MDA含量升高及SOD活性下降[19-21]。

在本试验中，宣痹通瘀胶囊预防性给药可以明显改善心脏功能指标；降低心肌梗死面积；明显降低心肌细胞凋亡率，有效抑制细胞凋亡；血清中CK-MB、LDH、cTnI 含量显著降低；能够明显提高体内SOD的活性；可以有效减少MDA的含量；综上可见，宣痹通瘀胶囊对心肌缺血/再灌注损伤有明显的保护作用。