刘闯，丁黎

（中国药科大学，江苏南京 211100）

双特异性抗体（以下简称“双抗”）可以同时特异性结合2个不同的抗原，其在自然状态下不存在，只能通过人工方式制备。双抗因其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤免疫治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景[1]。作为蛋白质药物的一种，抗体制品在溶解于不同溶液时其氨基酸侧链、C端和N端展现出带不同电荷的能力，同时在表达、生产过程中的翻译后修饰或构象变化也会导致电荷分布变化，形成电荷异质体。电荷异质体对蛋白类药物的稳定性与生物活性有重要影响，是抗体药物生产的关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）[2-3]。《中华人民共和国药典（2020年版）》中收录了全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing，WCID-CIEF，或称iCIEF）作为一种用来分离、分析蛋白质电荷异质体的方法。然而，双特异性抗体的分子结构与理化性质复杂，通常需要针对特定分子进行方法开发，以获得具有良好专属性、重现性和分离度的WCID-CIEF方法。本文基于双特异性抗体对专属性WCID-CIEF方法开发策略进行介绍，包括添加剂、载体两性电解质种类与比例、占位剂、上样量、等电点标记物以及工作溶液稳定性等方面，以期为双抗分子的质量研究提供参考。

1 WCID-CIEF概述

依据不同电荷异质体的等电点特征进行分离的毛细管电泳技术是分离蛋白质最具分辨率的方法之一。与传统的平板凝胶相比，毛细管电泳使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，能够降低焦耳热，从而确保引入高电场强度，全面改善分离质量[4]。不同的电泳模式包括毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）和毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）等。其中，毛细管等电聚焦电泳的实验装置通常包括在阴极上的碱性电解液和在阳极上的酸性电解液，毛细管及检测系统。通过施加高电压，在毛细管内部建立起pH梯度，当蛋白质的pI值高于所处环境的pH值时，蛋白质就带正电，反之则带负电。当电场作用于毛细血管时，蛋白质会向电荷相反的电极移动，当蛋白质到达与自身pI相同的pH值区域时，蛋白质上的电荷会降低到零，一开始充满整个毛细管的蛋白质，在沿毛细管的pH梯度上，根据它们的pI聚集成尖锐的带，聚焦条带在280 nm波长条件下进行检测[5]。利用在样品中加入的两种已知等电点的标记物标定出待测样品的等电点，同时得到电荷分布图谱，采用峰面积归一化法可以得到不同成分含量[6-7]。与两步聚焦的CIEF仪器需将样品区带迁移至检测窗口不同，WCID-CIEF通过捕获整个毛细管分离区的图像来避免移动步骤造成的条带扩散或变形[8]。同时，该技术通过基于电荷耦合元件（Charge-Coupled Device，CCD）或互补金属氧化物半导体（Complementary Metal-Oxidesemiconductor，CMOS）的成像装置获得实时查看分离的优势[9]，因此可以很容易地确定聚焦时间的结束，广泛应用于蛋白药物pI的测定和电荷异质性的分析[10]。

目前市场上进行全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测的主流设备有美国Protein Sample公司生产的全柱成像毛细管等电聚焦分析仪与Maurice系列，以及与仪器匹配的氟碳涂层毛细管[11-14]。相较于全柱成像毛细管等电聚焦分析仪，Maurice系列对自动进样器进行整合，简化了维护步骤，并增设了自发荧光检测器，应用范围更加广泛[15]。在上样检测前，需将样品与预混液混合，预混液中通常包括等电点标记物、载体两性电解质、1%的甲基纤维素及添加剂等成分[16]。WCID-CIEF专属性的方法开发需要结合双特异性抗体的理论等电点，设置初始方法并在此基础上对相关参数进行优化[17]。

2 方法开发策略

根据Protein Simple公司提供的全柱成像毛细管等电聚焦分析仪用户使用指南，设计初始方法。将30 μg待测样品与预混液混合，预混液包括35 μL 1%的甲基纤维素、涵盖双抗理论等电点范围的两种等电点标记物（一高一低）各0.5 μL以及宽范围的载体两性电解质（如Pharmalyte pH 3～10）4 μL，用超纯水补足到100 μL。预聚焦电压1 500 V，持续1 min；聚焦电压3 000 V，持续8 min。自动进样器样品盘温度设置为10 ℃。其中，样品最终盐离子强度应小于15 mmol/L NaCl，否则需对样品进行换液，避免因离子强度过高，导致聚焦过程中电流过强而损伤毛细管或引起蛋白质变性[17-18]。根据初始条件获得双抗分子的电泳谱图，基于谱图表现从添加剂、载体两性电解质种类与比例、占位剂、等电点标记物、上样量以及工作溶液稳定性等方面进行方法优化，以保证良好的谱图重现性与分离效果。

2.1 添加剂优化

在聚焦过程中，蛋白质倾向于在其pI值附近沉淀，这是由于蛋白质随着聚焦进行自身净电荷被中和且高度浓缩，导致可溶性下降发生聚集或沉淀[19]。待测样品的聚集或沉淀会造成电流异常、谱图不可重复，且有堵塞毛细管的风险。因此，需要在待测样品中加入合适的添加剂，促进蛋白质溶解。在等电聚焦电泳中，具有增溶作用的添加剂不应增加样品内的盐离子浓度，同时必须与高电压兼容且在0～280 nm具有较低的紫外线吸收率，以便可以检测蛋白质分析物[20]。

尿素（CH4N2O）是常见的非离子型去垢剂，能够断开蛋白质样品的非共价键连接，促进蛋白质的溶解[16]。通常可配制终浓度为1～8 mol/L的尿素进行重复进样分析，观察谱图重现性。若样品在多个尿素浓度下均不沉淀，则选择分离效果最好且尿素浓度最低的条件，从而减小尿素对像素位置与pI线性的影响[16]，避免高浓度尿素导致蛋白质变性[21]。另外，尿素应现配现用，否则部分降解的尿素会造成蛋白的氨甲酰化，产生蛋白异构体[22-23]。

甲酰胺（CH3NO）的化学结构和功能与尿素非常相似，是WCID-CIEF中另一种常用的添加剂，推荐用量为10%～45%（体积比）[24]。此外，对于一些难以变性的蛋白质来说，可以考虑使用作用力更强的去垢剂，如乙基脲、N-乙基脲、N-丁脲等[20]。

由于人工制备的各种双特异性抗体的分子结构与理化性质更加复杂，常见的添加剂可能无法实现良好的增溶效果，因此一些非去垢剂组合可以考虑应用在双抗分子的WCID-CIEF分析中。非去垢剂磺基甜菜碱（NDSB）用于改善膜蛋白的溶解度[25-26]，牛磺酸不参与蛋白质的合成[27]，因此，由NDSB和含硫氨基酸牛磺酸（T）组合得到的添加剂NDSB-T可以安全地用作蛋白质制剂的赋形剂[28]，其能够在保持蛋白质完整性的同时具有良好的稳定性和分离效果[25]。推荐NDSB-T用量为NDSB 0.5 mol/L，牛磺酸10 mmol/L[25]。

此外，一些在毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）中常用的添加剂，如甘油[4-5（]推荐用量为5%～25%）、山梨醇[5]（推荐用量为0.2%～2.0%）、蔗糖（推荐用量为5%～25%）、Simplesol[29（]推荐用量为5%～40%）等也可在WCID-CIEF方法开发中进行尝试，以防止蛋白质沉淀或聚集，保证谱图重现性。

2.2 载体两性电解质种类和配比优化

载体两性电解质是等电点相近、分子量为1～2 kDa的多氨基多羟基两性化合物的混合物。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动；在小于其等电点的pH环境中解离成带正电荷的阳离子，向电场的负极泳动，从而在预聚焦阶段形成稳定、连续的pH梯度。在聚焦过程中，样品溶液的电导率和pH值不断改变，加入载体两性电解质可以有效抵消上述效应，并维持pH梯度的稳定[30]。

市面上可供选择的载体两性电解质品牌有很多，不同品牌的载体两性电解质有不同的化学结构或电离基团[31-33]。其中，Pharmalyte系列的载体两性电解质在280 nm基线噪音小，且对大多数蛋白类分子都有较好的分离效果[15]。因此，在WCID-CIEF方法开发中，可选择Pharmalyte系列作为初始方法的两性电解质并在此基础上进行优化[34]。

待测样品中，载体两性电解质的体积分数在2%～8%。载体两性电解质的范围必须涵盖样品的pI值范围，同时为了兼顾分离效果和时间，通常会将宽、窄范围的载体两性电解质搭配使用。以Pharmalyte系列为例，在初始方法中只加入4 μL的宽范围两性电解质（Pharmalyte pH 3～10），若双抗分子的分离效果较差，则可根据样品各成分的等电点选择窄范围载体两性电解质（Pharmalyte pH 2～5，5～8），配比为1∶1～1∶3[16]，同时比较不同配比下的分离效果。需要注意的是，窄范围载体两性电解质的加入可能会使样品在初始聚焦时间内聚集不完全，不同pI值的样品在规定时间内无法到达对应的位置，比较临近聚焦结束的几个时间节点捕获的电泳谱图仍可观察到明显变化，此时可考虑增加第二阶段的聚焦时间至8～12 min[34-35]。

2.3 占位剂优化

在WCID-CIEF检测中，有时会观察到高pI值或低pI值的部分样品漂移出检测窗口。这种现象可能是由于阴、阳极端发生等速电泳，致使毛细管阴阳极末端的载体两性电解质在聚焦过程中损耗[36]，最终导致阴极或阳极漂移[37]。此外，阴极漂移还可能受到电渗流的影响，由于氟碳涂层毛细管内部的电渗流无法完全消除，在聚焦过程中，毛细管内全部成分会向阴极端移动，导致高pI值的等电点标记物或待测样品谱图漂移出检测窗口[38-39]。为避免上述因素对WCID-CIEF检测影响，可在待测样品中加入占位剂。

占位剂本身就是良好的两性电解质，在pH梯度中占据了毛细管两端相对稳定的位置，作为牺牲性两性电解质防止载体两性电解质的损耗，避免阴阳极漂移。阳极端占位剂的pI值应高于阳极电解液，且pH值＜3。常用的阳极端占位剂为亚氨基二乙酸，pI值为2.2；阴极端占位剂分子的pI值低于阴极电解液，pH值＞10，常用的阴极端占位剂为L-精氨酸，pI值为10.7。此外，由于加入占位剂会压缩pH梯度，可能导致分离度下降，因此占位剂的浓度不应过高，一般为2～10 mmol/L[18,38]。

2.4 上样量和等电点标记物优化

通常在100 μL体系中加入20～50 μg样品，使样品主峰在0.1～0.6 AU，避免过载或低于仪器检测限度。等电点标记物为小分子物质，在280 nm波长下呈现单一、显著的峰，为了减小误差，等电点标记物应当尽可能地靠近目标蛋白两侧，一般在其pI的0.5～1.0个pH单位。此外，有些等电点标记物的成分为多肽，如Protein Simple公司生产的等电点标记物4.05、5.85、6.14、8.40、8.79和9.50可能会被羧肽酶等水解。因此，在使用羧肽酶对样品进行前处理时，应避免使用上述等电点标记物[39]。在方法开发中，可能会观察到不同等电点标记物组合所测得的同一样品的等电点存在差异。因此，在完成方法开发后，应使用同一等电点标记物组合进行批间检测、放行和稳定性考察。

2.5 工作溶液稳定性优化

由于双抗分子结构复杂，WCID-CIEF预混液组成成分较多以及毛细管电泳本身的限制，双抗分子在进行专属性WCID-CIEF方法开发时，需要注意对工作溶液稳定性的考察[6,40]。一般需要考察工作溶液在24～48 h的谱图重现性。当谱图无法重现时，一方面可考虑降低自动进样器样品盘温度至5～8 ℃，重新考察方法的工作溶液稳定性[16,41]。此外，若添加剂为高浓度尿素，则样品盘温度不可过低，否则尿素会在低温环境中析出从而堵塞毛细管。另一方面，可尝试改变添加剂或载体两性电解质的种类（见2.1、2.2），以提高工作溶液稳定性。

根据2.1～2.5的优化方法确定参数后，可参考药品评审中心发布的《生物制品质量控制分析方法验证技术评审一般原则》[42-43]，对方法的专属性、精密度、线性、耐用性等进行评估并设置质量接受标准。

3 结语

治疗性蛋白作为一种在大小、电荷和聚糖组成上具有异质性的复杂化合物，其分析和鉴定是生物药物开发中的关键任务之一。双特异性抗体的复杂分子结构在工艺开发过程中带来了独特的挑战，对抗体药物的质量控制提出了新的要求。全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术提供了一个快速、高分离度、可重现的选择，在生物制药行业有着广泛的应用前景。开发或优化专属性的WCID-CIEF方法能够对不同阶段的抗体制品的电荷异质体进行有效监控，并结合其他分析技术为上下游工艺优化提供选择依据，对提升产品质量、保证工艺稳定性具有重要意义。