侯敏哲 李婷 倪敬年 魏明清 张卓 时晶

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是痴呆症的第二大常见原因,也是全球范围内的主要健康问题,是由大脑特定区域缺血性或出血性损伤后出现的认知功能障碍[1]。 一项流行病学调查显示,2019 年全球VD 的患病率增加[2]。 我国对VD的流行病学研究较少,据2014 年在中国大陆进行的多地区人群调查结果显示,我国65 岁以上老年人VD 的患病率为1.5%[3]。 随着我国人口老龄化的加重,VD 的患病率逐年增高,其治疗和康复为家庭照顾者和社会带来严重的经济负担。

目前,VD 的有效治疗远比阿尔茨海默病的治疗更为困难。 临床上治疗VD 多使用多奈哌齐、美金刚、尼麦角林、尼莫地平等药物,虽有一定疗效,但是作用有限[4]。 针刺是一种传统的中医疗法,操作简便,副作用小,已广泛应用于临床治疗,临床疗效多有报道[5-7]。 近年来关于针刺治疗VD 的实验研究越来越多,从细胞凋亡、血管再生、自由基清除、神经递质和炎性反应等多个方面揭示了针刺治疗VD 的作用机制[8-12]。 分子生物学机制研究显示神经递质的表达水平与VD 关系密切[13-15]。 到目前为止,还没有研究分析针刺对VD动物模型中神经递质表达水平影响的研究。 因此,本研究系统评价针刺对VD 动物模型神经递质的影响,为针刺治疗VD 的临床疗效提供更充足的循证医学证据支持,也为未来动物实验的研究设计提供更有价值的研究方向。

1 资料与方法

1.1 检索方法

文献检索由两名研究员独立进行,分别在中文数据库如中国期刊全文数据库(CNKI)、维普期刊数据库(VIP)、万方数据资源系统(Wanfang)和英文数据库如PubMed、Web of science 数据库中检索已经公开发表的有关VD 动物实验的相关研究,时间为建库至2021 年6 月。 检索词采用主题词与自由词相结合。 中文检索词为针刺、针灸、VD、动物、鼠等,英文检索词为 vascular dementia、acupuncture、rat、mice等。 同时配合手工逐条检索,避免缺失或遗漏。

1.2 纳入标准

根据PICOS 原则进行文献的纳入筛选,符合以下条件即可纳入。 (1)研究对象VD 动物模型;(2)研究方法中设置含有独立对照组和治疗组;(3)干预措施为针刺,包括灸法,实验内容中造模方法、动物种类、针刺方法、针刺穴位不限;(4)结局指标包括主要结局指标神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素(noradrenaline,NE)、多巴胺(dopamine,DA)、乙酰胆碱(acetyl choline,Ach)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和次要结局指标Morris 水迷宫实验、跳台实验;(5)研究类型符合随机对照实验。

1.3 排除标准

(1)体外实验研究;(2)重复发表的研究;(3)会议论文或无法获取详细数据的研究;(4)实验设计不合理或无对照组的研究;(5)针灸联合其他中药或西药治疗的研究。

1.4 文献筛选与资料提取

2 名研究员根据筛选策略进行文献筛选并评估,遇到分歧时将由第3 名研究员进行评估解决。相关研究资料的提取信息包括研究特征(研究标题、第一作者、发表年份),纳入的动物和动物模型的特征(动物品系、动物模型、干预组和对照组样本量、造模方法),干预措施(治疗措施、对照措施、疗程等),结局指标。 在数据提取前进行统一校准,确保一致性,并将上述资料绘制成表格。

1.5 文献质量评估

纳入研究的方法学质量根据SYRCLE 动物实验偏倚风险评估工具(SYRCLE's risk of bias toolfor animal studies)[16]进行偏倚评估,偏倚类型包括选择性偏倚、实施偏倚、测量偏倚、失访偏倚、报告偏倚和其他偏倚。 评估结果见表2。

1.6 统计学处理

采用Review Manage 5.3 对纳入的数据进行统计分析。 所有研究结果视为连续型数据。 由于实验采用不同的测量工具用不同的测量单位进行测量,因此使用标准化均数差 (standardized mean difference,SMD)进行效应合并。 对纳入的各独立研究进行异质性检验(test for heterogeneity),通过计算I2值估计研究之间的异质性,若P>0.10 或I2>50%,表明存在高度异质性,则采用随机效应模型,并且可以进行异质性分析和处理。 若I2在25% ~50% 之间,表明研究存在中度异质性;若I2<25%时表明研究存在低度异质性。 若无法消除异质性,可认为存在异质性。 文献发表偏倚满足分析条件(至少纳入10 项研究)时用漏斗图分析。

2 结果

2.1 文献检索结果

根据已制定的文献筛选标准,从数据库中初步检索文献443 篇,阅读题目、摘要及全文,排除不符合标准文献,最终纳入7 项研究[17-23]。 文献筛选流程及结果见图1。

图1 文献筛选流程及结果

2.2 纳入文献一般特征

本研究共纳入7 项研究[17-23],共涉及184 只动物。 对照组总数为90 只,实验组总数为94 只。 动物品系:3 项研究[17-18,22]使用 SD 大鼠,3 项研究[19-20,23]使用Wistar 大鼠,1 项研究[21]使用昆明小鼠。 造模方法:7 项研究[17-23]均采用国际公认的二血管阻断或四血管阻断法造模。 干预方法:3 项研究[17,22-23]使用传统针刺干预,3 项研究[18-19,21]使用电针干预,1 项研究[20]使用头穴丛刺法干预。 纳入文献筛选的基本特征见表1。

表1 纳入文献的基本特征

2.3 文献偏倚风险评价

采用SYRCLE 动物实验风险评估工具进行偏倚风险评价。 评价内容包含10 个条目,评估结果以“是”“否”“不确定”分别表示低、高及不确定偏倚风险,见表2。

表2 纳入文献偏倚风险评价

3 结果分析

3.1 VD 模型鼠脑组织神经递质5-HT、NE、DA、Ach、GABA 表达水平分析

3.1.1 脑组织5-HT 的表达水平分析 纳入研究中5 项研究[17,19-22]进行了5-HT 的检测,Meta 分析结果表明针刺对提高VD 模型鼠脑内5-HT 的表达较模型组有影响。 针刺组脑内5-HT 的表达明显高于模型组(SMD=1.43,95% CI[0.83,2.00],P<0.01),且两组的差异有统计学意义(Z=4.89,P<0.01)。 见图 2。

3.1.2 脑组织 NE 的表达水平分析 4 项研究[17,19,21,23]检测了脑组织内NE 的表达水平,结果表明较模型组相比,针刺对提高VD 模型鼠脑内NE的表达有影响。 针刺组脑内NE 的表达高于模型组(SMD=2.09,95%CI[0.58,3.61],P<0.01),两组的差异有统计学意义(Z=2.70,P=0.007<0.01)。见图3。

3.1.3 脑组织 DA 的表达水平分析 4 项研究[17,19-21]表明,针刺提高了脑VD 模型鼠脑组织内DA 的表达。 分析结果显示针刺组脑内DA 的表达明显高于模型组(SMD = 1.75,95% CI[0.74,2.75],P<0.01,两组的差异有统计学意义(Z=3.42,P=0.0006<0.01)。 见图 4。

3.1.4 脑组织Ach、GABA 的表达水平分析 因纳入研究较少,仅有2 项研究[17,20]报告了脑组织Ach的表达水平,仅有1 项研究[18]进行了VD 模型鼠脑组织GABA 的检测,结果显示VD 模型组小鼠脑组织中GABA 的表达水平明显高于对照组[针刺组(279.20±34.40)VS 对照组(236.80±30.09),P>0.05]。 其中两项研究中针刺组VD 模型鼠脑组织内Ach 的表达水平均高于模型组,表明针刺能够提高模型鼠脑组织Ach 的表达。

3.2 Morris 水迷宫实验、跳台实验结果分析

纳入研究中有4 项研究[17-18,20,22]进行了Morris水迷宫实验,结果显示针刺组的Morris 水迷宫逃避潜伏期低于模型组(SMD=-3.07,95%CI[-4.94,-1.2],P<0.01),两组的差异有统计学意义(Z=3.22,P=0.001<0.01);2 项研究[17,21]进行了跳台实验,结果显示针刺组错误次数均低于模型组(SMD=-3.72,95%CI[-6.72,-0.73],P=0.01),两组的差异有统计学意义(Z = 2.44,P= 0.01<0.05),这说明与对照组相比,VD 模型鼠经针刺干预后平均逃避潜伏期减少,跳台实验错误次数减少,提示针刺可能改善VD 模型鼠的学习记忆能力。

3.3 异质性分析

VD 模型鼠脑组织内5-HT 的表达水平分析(图2)结果显示P=0.09>0.05,I2=50%,表明所纳入的研究具有统计学上的同质性,可以使用固定效应模型进行分析,但为使效应合并结果更具客观说服力,因此仍采用随机效应模型进行分析。 脑组织内NE 表达水平(图3)、DA 表达水平(图4)、水迷宫逃避潜伏期(图5)、跳台实验错误次数(图6)分析结果显示P<0.05,I2分别为88%、78%、90%、87%,均大于50%,表明纳入文献异质性较大,采用逐一去除法进行异质性检验,结果显示I2值相差不大,未能消除异质性,因此采用随机效应模型进行分析。 因纳入研究样本量较少,未使用漏斗图进行发表偏倚分析。

图2 VD 模型鼠脑组织5-HT 的表达水平森林图

图3 VD 模型鼠脑组织NE 的表达水平森林图

图4 VD 模型鼠脑组织DA 的表达水平森林图

图5 Morris 水迷宫逃避潜伏期森林图

图6 跳台实验错误次数森林图

4 讨论

本研究表明,与对照组相比,针刺可以明显降低VD 动物模型脑组织中5-HT、NE、DA 的表达水平。 在行为学实验中,与对照组相比,针刺干预可以延长VD 动物模型的Morris 水迷宫实验的逃避潜伏期,减少跳台实验错误次数,这表明针刺在改善VD 动物模型的的学习记忆能力具有一定潜力,但因文献较少,此结果仍需要大量实验进一步验证。

VD 在中医学中属于“呆病”“痴呆”范畴,病位在脑,涉及心、肝、脾、肾等脏腑。 针刺疗法是中国医学特有的治疗形式,根据脏腑经络理论为指导,选择特定的穴位或穴位组合,结合适当的针刺手法刺激人体做出反应,以平衡阴阳,改善气血运行及调整脏腑功能,从而达到治疗疾病的目的。 经过不断发展,传统针刺疗法与现代技术相结合衍生出电针、药线灸等多种穴位刺激方法,在VD 的治疗中也发挥了巨大的作用[24-25]。

既往研究揭示了神经递质与VD 的关系[26-28]。神经递质的表达水平可以直接反应脑组织受损情况,是VD 疗效的重要评价指标[29]。 单胺类神经递质与认知功能关系密切,对注意力、记忆力和反应能力有重要的调节作用[30],主要包括 NE、DA 和5-HT。 NE 能作为独立神经递质进行神经活动,与记忆力关系紧密,参与调节人的睡眠情感、注意力、行为等功能[31];DA 是中枢神经系统中一种重要的神经递质,在调节额叶记忆、控制运动功能中起重要作用[32];5-HT 主要分布在大脑皮质、海马等区域,能够调节情绪,与认知行为、学习记忆能力、睡眠节律有关[33];Ach 是乙酰辅酶A 和胆碱在胆碱乙酰转移酶作用下合成的重要神经递质,对谷氨酸能神经元活动的调节和海马神经元的发育非常重要,传递神经冲动,参与学习记忆活动[34]。 针刺干预能够提高VaD 患者的认知水平,改善VD 大鼠的学习和记忆能力,抑制神经凋亡,降低神经递质的水平[35-37]。 本研究Meta 分析结果显示,针刺可以提高VD 模型鼠脑内神经递质 5-HT、NE、DA 和 Ach 的表达,与既往研究结果一致。

与以往研究VD 的评价相比,本研究以动物模型为研究对象,对动物实验的方法学进行系统评价,有助于提高临床前动物研究的方法学质量,为动物实验标准化提供参考。 方法学评价对于衡量证据的质量和评估动物试验中的偏倚风险具有重要意义。 然而在本研究中,方法学评价结果显示很多不足,如多项研究中对分配序列的隐藏、结果报告及随机选择并未明确描述,对研究者和结局评价者的盲法描述不清楚,因此评价结果不尽如人意。

本研究存在一定的局限性:(1)纳入文献较少,异质性高。 现有研究中符合纳入标准的研究关于神经递质的检测较少,且所纳入的研究对神经递质的表达水平检测方法不一致,在脑内组织海马和皮层的检测水平不同,结果报告中对结局指标的评价单位不一致,因此异质性较高。 (2)方法学评价文献质量偏低,总样本量偏少,导致Meta 分析结果可能偏倚性较高。

基于此,建议在今后的实验设计中,应完善随机序列的产生和分配隐藏方法,对研究者和结局评价者以合理方式施盲,结局报告中应满足随机选取动物进行结果评价,并对缺失数据进行详细报告,提高实验设计的质量。

本研究结果表明针灸确实可以增加VD 动物模型神经递质的表达水平,可能改善VD 模型鼠认知能力,据此推测针刺可以通过调节神经递质来改善VD 学习和记忆能力,但因样本量偏少,影响资料的全面性,仍需要设计标准合理的动物实验来验证结论的确切性,并在VD 临床试验中进一步探索这一领域。