侯对虎 方子寒 李西文

种质资源是药用植物遗传研究和品种选育的基础。 表型性状的测量与评价是研究种质资源多样性最直接和简便的研究方法,可为新品种选育提供依据。 太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根,具有益气健脾、生津润肺之功效。 野生太子参分布于华东、华北、东北和西北等地的阴湿下坡、林下、草从或岩石缝内。 太子参的种质资源存在丰富的多样性[1-2]。 但由于生态环境变化,导致太子参野生资源濒危。 目前太子参商品药材主要来源于人工栽培品种。 近年来,关于太子参的现代科学研究主要集中在化学性质、药理作用及种植方式的品质评价等方面。 HU 等[3]研究发现太子参多糖(PHP)具有较好的降血糖活性,可以明显改善胰岛素的耐受,抑制炎症因子TNF-α 和抗炎因子IL-10 的表达,发挥胰岛素增敏作用;蔡巧燕等[4]分离得到太子参18 株内生菌并进行体外抗氧化实验,表明太子参内生菌具有一定的抗肿瘤、抗氧化活性,可以作为筛选抗肿瘤先导化合物的潜在资源;龙正龄等[5]以不同种源太子参种参为研究材料,从生物学性状、生长后期病害情况等方面展开研究,结果发现种参的选择对产量和品质尤为重要;熊厚溪等[6]基于性状和药材品质对贵州8 个太子参品系进行了筛选与评价;巫小宏等[7]比较不同太子参种植材料(种子繁殖、块根繁殖)的产量、病害、经济效应指数。 但针对太子参的种质资源多样性研究较少,针对表型分类的资源评价更是鲜有文献报道。 太子参种质资源混杂、栽培种植盲目引种、扩种以及生产中连作障碍等,严重制约了太子参药材产业化的健康发展。 本研究通过田间太子参的表型筛选、生物学性状测量、遗传多样性计算、药用成分含量及产量分析等,评价太子参种质不同表型的差异性,以期为筛选太子参新品种选育和种群遗传学研究奠定基础,也为其它药用植物表型资源评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验区

栽培太子参选用贵州黔东南地区施秉县农家种根。 基地位于贵州省黔东南苗族侗族自治区施秉县牛大场镇黄泥田(东经 107°57′26″、北纬 27°11′24″),属亚热带湿润季风气候区,其土壤类型为沙壤土,年平均气温15.3℃,年降水量1232.9 mm,年日照时数1045.1 小时,年平均相对湿度83%,种植区域形状呈“弓形状”,以保证土壤的排水系统良好。

1.2 实验试剂与仪器

环肽B(成都普瑞法科技开发有限公司,批号:PRF22030341),色谱级甲醇(纯度>95%,赛默飞世尔科技有限公司),分析甲醇(纯度>95%,北京化工厂),色谱级乙腈(纯度>95%,赛默飞世尔科技有限公司),800Y 型多功能粉碎机(武义海纳电器有限公司),RE52CS 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),KQ-500DE 型数码超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),DGG-9070B 型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),ME204/02 型1/10 万电子天平(上海菁海有限公司), Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS 超高效液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 生物学性状测量 2020 年12 月栽种,栽种前撒入基肥,播撒种子,覆土2 ~3 cm,株行距10 cm×25 cm,3 月出苗后间苗,其它与当地栽培管理习惯进行日常管理。 太子参出苗后,于生长旺盛期,利用不同颜色标记牌记录不同表型植株,并选取长势一致健康植株各30 株,各表型随机取样13 株,分别测量株高(cm)、冠幅长(cm)、冠幅宽(cm)、叶片长(cm)、叶片宽(cm);倒苗期进行采样,于7 月28 日至8 月3 日采挖所有表型的太子参块根,并测量和统计中部根粗(mm)、根长(cm)、单株鲜重(g)、单株干重(g),同时根据单株鲜重和种植密度(20000株/亩),估算各表型植株的亩产量。

1.3.2 环肽B 含量测定 (1) 对照品溶液的制备[8]。 精密称取太子参环肽B 对照品1.65 mg,置于5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容,作为对照品储备液。 精密吸取环肽B 1.45 mL 置10 mL 量瓶中,用甲醇定容,即得环肽B 浓度为47.85 μg/mL 的对照品溶液。 (2)供试品溶液的制备。 取太子参药材粉末(过四号筛)约2 g,用万分之一天平精密称定,精密加入甲醇50 mL,称定重量,超声处理45 分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 mL,至圆底烧瓶中,利用旋转蒸发仪浓缩至干,残渣加甲醇溶解,转移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀0.22 μm 滤膜过滤,取滤液作为样品溶液。 (3)色谱条件。 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS 超高效液相色谱条件测定,XBridge C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.5 μm),以乙腈为流动相A,H20 为流动相B,按照梯度洗脱:0 分钟,98%(A) ~2%(B);10 分钟,72%(A) ~28%(B);20 分钟,42% (A) ~ 58% (B),流速为0.5 mL/min,柱温35℃,检测波长为203 nm。 用太子参环肽HB(Heterophyllin B)的对照品做标样。 精确吸取2 μL 样品溶液进行分析测定,记录峰面积,根据对照品与样品的峰面积计算太子参环肽HB(Heterophyllin B)的含量。

1.4 数据处理与分析

Shannon-Weaver 多样性指数[9]生物学性状根据每个性状的平均观测值(x)和标准差(σ),按照x=kσ(其中 k=0、0.5、1、1.5、2)将每一性状的观测值划分为10 个等级,分级后的数据按照公式H′ =-计算多样性指数(H′),其中,P表i示某性状第? 等级的分布频率,该频率为处于第?等级的材料个数占总材料之比。

使用 Excel2021 进行数据记录和整理;利用IBM SPSS 24.0 软件进行单因素方差分析,Duncan法检验显著性,主成分分析,并利用在线软件(https:/ /www.metabo)[10]对8 个生物学性状进行相关性分析,使用Origin2022 进行绘图。

2 结果

2.1 太子参生物学性状分析与表型分类

2.1.1 太子参地上植株特点及表型分类 按照叶宽分类。 在太子参生长旺盛期,观察并记录太子参地上部植物学特征,可根据叶宽分为3 类:大叶型(叶片宽>4.0 cm)、中叶型(叶片宽3.5

图1 太子参3 种表型叶片特征

2.1.2 按照花和茎分类 太子参一般顶端着生一朵花(少量2 ~3 朵),花瓣5。 田间发现部分太子参为聚伞花序,成簇状分布(图2A1、2),将其命名为多花型。 大部分太子参植株在茎部表现为主茎单一,而部分植株茎顶端主茎均等一分为二(图2B1、2)。 依据其生物学特征,将其命名为双柱型。 其形态学特征为茎顶端均等分裂,叶片表面有绒毛。

图2 多花型和双株型的形态特征

2.1.3 太子参根部特点 通过对5 个表型的根长(SRL)、中部根粗(MT)、单株鲜重(FWP)比较分析(表1),发现不同表型根部特征和单株鲜重存在显著性差异,并且双柱型和多花型的单株鲜重差异极显著。 大叶型表现为根细,块根纺锤形,须根少,根表皮为黄色,块根少而小;小叶型中部根直径较粗,块根圆棒形且较多,根表皮为淡黄色,可作为高产繁殖材料;中叶型根部形状细而长呈长圆条形,根表皮为淡黄色,上部较粗,往下依次变细;双柱型根表皮为黄色,茎较粗,须根较少,下部有明显的主茎,顶部为双茎型,块根多而细;多花型须根较多,块根较细,表皮呈淡黄色。 小叶型中部根粗区别于其他表型较粗。 从根长性状差异分析表明,中叶型的根长(表1)与其他的表型呈现极显著差异性(P<0.01),而大叶型与小叶型之间差异性不明显。

表1 太子参不同生物学性状比较(, n=65)

表1 太子参不同生物学性状比较(, n=65)

注: a、b、c 代表不同表型生物学性状间存在显著差异(aP、bP、cP、dP<0.05,aP、bP、cP、dP<0.01)。

性状 大叶型 小叶型 中叶型 双柱型 多花型株高(cm) 9.79±1.93b 7.58±1.46a 10.48±1.57b 12.28±2.20c 9.79±2.44b冠幅长(cm) 16.14±1.31d 9.76±0.90a 15.33±1.22cd 14.22±2.58bc 13.12±3.38b冠幅宽(cm) 14.20±1.35d 9.02±0.99a 12.99±2.52cd 11.87±1.74bc 11.15±2.15b叶片长(cm) 7.97±0.53c 4.87±0.48a 7.65±0.60c 6.81±1.02b 6.64±1.69b叶片宽(cm) 4.94±0.37c 2.76±0.19a 3.29±0.29b 3.54±0.51b 3.50±0.79b单株鲜重(g) 11.50±0.97b 18.02±1.31d 17.17±1.54d 14.42±3.29c 8.59±1.25a中部根粗(mm) 4.16±0.75b 5.14±0.45c 4.49±0.54b 4.32±0.59b 2.97±0.39a根长(cm) 6.55±1.39b 7.03±1.19b 11.02±2.22d 9.47±1.44c 4.42±1.31a

2.2 基于生物学性状的太子参遗传多样性分析

对太子参的8 个生物学性状进行多样性分析(表2),变异系数为21.1% ~ 36.0%,平均值为24.7%。 根长(SRL)的变异系数最大,其次是叶片长(LL),冠幅宽(CW)最小,变异系数大小排列顺序为根长>单株鲜重>株高>叶片宽>冠幅长>叶片长=中部根粗>冠幅宽。 变异系数较大为根长、单株鲜重、株高,表明这3 个生物学性状变异幅度较大;而变异系数较小的为叶片长、中部根粗、冠幅宽,表明这3 个生物学性状的变异幅度较小,遗传特性较为稳定。 在遗传多样性指数方面,冠幅宽(CW)、单株鲜重(FWP)、根长(SRL)的多样性指数最高,均超过2.00,其他的表型多样性指数都超过1.90。 8 个生物学性状平均多样性指数达到1.97。 综合表明,太子参种质资源各性状之间具有显著性差异和明显的多样性。

表2 太子参不同生物学性状多样性分析(n=65,cm)

图3 太子参5 种表型根部性状特征

2.3 太子参不同生物学性状的相关性分析

太子参不同表型生物学性状相关性分析结果(图4) 表明,叶片宽与单株鲜重呈现极显著(P<0.01)负相关,植株叶片越大,其地下生物量的积累量越少;株高与冠幅宽、叶片宽、叶片长呈极显著(P<0.01)正相关,而与中部根粗、单株鲜重显著负相关,根长与中部根粗、叶片宽呈显著负相关,与叶片长、株高显著正相关,综合比较太子参的地上性状与地下部分相关性,结果表明地上生物量的积累与地下生物量的积累呈负相关。

图4 太子参不同生物学性状相关系数

2.4 太子参不同生物学性状的主成分分析及差异性分析

对太子参8 个生物学性状进行主成分分析,以特征值大于1 为标准提取主成分,得到3 个主成分,累计贡献率达83.415%(表3),能反映太子参表型性状的基本特征。 第1 主成分的特征值为3.643,贡献率为45.537%,主要是冠幅长、冠幅宽、叶片长、叶片宽等,其特征向量都在0.5 以上,此类生物学性状均与地上生物量的积累有关。 表明第一主成分基本代表了地上生物量特征。 第2 主成分的特征值为1.933,贡献率为24.168%,主要由单株鲜重、中部根粗、根长等决定,该类性状主要反映地下生物量的积累。 第3 主成分的特征值为1.097,贡献率为13.709%,主要反映的是株高的形态特征。

表3 太子参不同生物学性状主成分分析(n=65)

2.5 太子参药用成分含量及产量分析

不同表型的样品环肽B 测量3 次重复,每个处理方法相同。 含量结果如表4,其HB 标准品的保留时间为tR=19.581 分钟;试样保留时间为tR=19.578 分钟,通过其峰面积和标准曲线计算可知,中叶型太子参HB 含量(表4)达到药典标准(不少于0.02%)。 评估不同表型太子参的产量,结果表明大叶型、多花型、双柱型3 个表型的产量之间呈现极显著性差异(P<0.01),而中叶型和小叶型之间没有显著性差异。 大叶型(230.15±19.43)显著高于多花型(171.84 ±24.96),而显著低于双柱型(288.31±65.85)。 中叶型(343.38±30.78)与小叶型(360.31±26.28)没有显著差异。 综合评价可知小叶型可以作为一种高产种质材料,而中叶型可以作为环肽B 含量较高的种质材料。

表4 太子参5 种表型的含量和亩产量测定结果比较(n=65)

3 讨论

野生太子参为多年生草本植物,人工驯化栽培后其生活史由多年生变为越年生,生态坏境、生活型的改变使太子参表现型出现多样性。 随着太子参的相继引种,各个产地和品种间种植材料的交流,也直接影响太子参品质和含量的均一性。 本研究以太子参主产区贵州省施秉县的人工栽培植株为研究对象,从太子参表型分类、生长发育特征以及经济性状等方面,对不同表型太子参的生物学性状、有效成分、产量进行比较分析,以探讨太子参不同表型与经济测量指标之间的相关性。 通过单因素方差分析可知,5 种不同的表型组间在产量上有显著性差异(P< 0.01)。 5 个表型的8 个生物学性状的相关性分析表明,叶片宽对于地下生物量的影响呈现负相关(图4),说明叶片越大,地下生物量越小,这与文献报道一致[11]。 叶片是地上生物量积累的主要营养器官,块根是太子参的地下生物量积累的营养器官,块根的膨大与否,和地上是否有足够的营养转化有直接相关。 在一定条件下,大叶型的叶片数较少,叶片总表面积及地上生物量较少,可能光合转化效率较小叶型低或暗呼吸效率高导致,光合总积累少于小叶型。 小叶型的种质可作为培育高产品种的潜在材料。

本研究结果显示,根长和单株鲜重2 个生物学性状多样性丰富,变异系数(CV)和Shannon-Weaver多样性指数(H')较高,冠幅宽变异系数(CV)值最低,说明冠幅宽在种间的稳定性较好,可视为今后优良品种选育的主要指标性状;8 个生物学性状主成分分析结果显示,3 个主成分的累计贡献率达83.415%,其中第1、2 主成分分别反映地上生物量和地下生物量的基本特征,此类累计贡献率较高的性状可便于区别其他杂种优势种质。

太子参花为二型花,即开放花和闭锁花,闭花受精作为植物非常特殊的繁育系统,同时存在正常开放可进行异交的开放花和闭锁不开放进行自交的闭锁花。 植物产生闭锁花进行后代延续,是被子植物适应坏境的一种非常有效的繁殖保障策略。LUO 等[12]人选用二型闭花受精植物石竹科孩儿参(pseudostellaria heterophylla)作为研究材料,利用转录组测序分析发现在开放花和闭锁花芽中一些花发育相关基因存在明显区别,认为闭锁花的产生与环境密切相关,闭锁花在花结构上表现为不同程度的退化,例如花很小,无花瓣,雄蕊数目和子房数目减少。 本研究在田间观察发现,太子参花的形态主要以开放花为主,表现为萼片5,花瓣5,同时发现少部分太子参花在形态学上与前人研究的闭锁花相异,其花瓣呈现簇状成球形,与文献报道的聚散花序相近,将其定义为新的表型-多花型。 另外,在太子参顶端存在茎二等分裂,表现为主茎粗壮,将其定义为双柱型,在后期田间观察比较发现其抗性能力较强,关于其抗性的评估尚需进一步研究。

药用植物种质资源的选育目标不仅要考虑其产量,还要考虑其品质。 目前没有明确的指标性成分评价太子参的品质,如2010 年《中华人民共和国药典(一部)》规定太子参含量测定项以环肽B 作为质量指标,而2015、2020 年《中华人民共和国药典(一部)》中并未出现该含量测定项。 本研究仅以2010 年《中华人民共和国药典(一部)》[13]的环肽B含量的检测方法对比不同表型含量差异,研究发现仅有中叶型太子参(表4)的含量达到标准(不少于0.02%),推测部分原因可能是由于种质资源的混杂;其次,缺乏新品种,种质退化导致。 因此,在太子参药材产业化中,需要不断的纯化、繁育,才可形成性状更稳定的纯系种质。 中叶型太子参不仅指标成分最高,产量也较高,可作为高产、高品质优良品种选育的首选种质材料。 杨昌贵等[14]研究不同种源的太子参的环肽B 含量表明,不同的生长环境(林下、大田)对于太子参环肽B 的积累有明显的差异,林下比大田的环肽B 含量高,遮阴在一定程度上有利于环肽B 的积累。 因此,可以模拟遮阴处理提高其太子参的环肽B 的含量。 另外,在种质资源圃选址的同时,考虑水分可能对于太子参的影响较大,因此选择具有坡度的地势,保证贵州频繁降雨带来的经济损失。 本研究在表型分类的基础上从生物学性状、药用成分含量和产量等方面开展了太子参的种质资源评价。 种质的遗传背景相同,材料基因型稳定,避免了常规以产地作为评价方式而忽视了遗传混杂的弊端,为太子参农田栽培生产管理措施的优化以及优良新品种选育奠定了基础,同时可为其它中药材种质资源的评价提供参考。