任文娟 赵晓燕

三七主要用于活血化瘀、消肿止痛等,近来发现其主要药效成分三七总皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)用于心脑血管疾病的治疗。 血栓通是中药三七的提取物,其主要成分为三七总皂苷,三七总皂苷中含多种单体皂苷成份。 血栓通注射液具有改善脑供血,增加脑灌注,抑制血小板聚集,降低血黏度等多种作用。 目前,血栓通注射液治疗脑卒中意见不统一。 有学者认为,血栓通注射液有助于脑卒中的恢复,如Meng LP 等[1]发现PNS 可通过miR-155 调控炎症因子的表达,减轻SH-SY5Y 细胞缺血再灌注损伤。 但还有一些学者对血栓通注射液的细胞保护作用持有相反意见,比如聂亚雄等[2]发现血栓通注射液治疗超早期大量脑出血时,可加剧早期脑水肿,引起大鼠神经功能缺损计分增加。 在哺乳动物中,存在三个高度保守的Hedgehog同源基因:SonicHedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh),它们分别编码Shh、Ihh 和Dhh 蛋白。 Shh 蛋白是一种细胞外的配体,Shh 通路上的启动蛋白。 细胞处于静止状态时,Shh蛋白与7 次跨膜受体Smo 蛋白结合,抑制Smo 活性,从而抑制其下游的反应。 当Shh 激活时,Shh 结合到12 次跨膜受体Ptch 蛋白上,解除Ptch 对 Smo的抑制作用,从而激活下游的Gli 家族蛋白,调节细胞周期进程、对抗凋亡、神经发生、细胞增殖和自我更新,参与损伤组织修复[3-4]。 近年来,Shh 通路在神经系统研究也颇多,如Jin 等[5]人发现Shh 激动剂激活Shh 通路可改善局灶性皮质缺血性损伤导致的行为缺陷。

本实验运用神经母细胞瘤细胞(SY5Y)及小鼠大脑皮层神经元,进行AAPH 氧化应激损伤,并将神经元进行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)处理,模拟体外脑卒中,观察神经元氧化应激损伤及缺血缺氧的作用及对Hedgohog-Patched-Smoothened 信号通路的影响,探究血栓通注射液对脑卒中神经元的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

美国癌症研究所(institute of cancer research,ICR)SPF 级孕15 ~17 天小鼠,购自北京维通利华实验动物有限公司[许可证编号:SCXK(京)2012-0001]。 SC8 细胞、cyclopamine 为陈伟导师馈赠;感受态细胞为北京天坛医院李昊文老师馈赠。

1.2 实验药物与试剂

血栓通注射液为北京天坛医院杜万良老师馈赠,产自广西梧州制药公司。 TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司;胰蛋白酶、DMEM 培养基、MEM 培养基、马血清(horse serum,HS)、胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)购自美国 Gibco 公司;台盼蓝、DNA 酶I 购自美国Sigma 公司;CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所,SAG 购自Santa Cruz Biotechnology。

1.3 细胞培养

1.3.1 孕15 ~17 天小鼠胎鼠皮层神经元细胞原代培养 培养板的预处理:25 cm 细胞培养瓶或96孔细胞培养板,加入0.1g/L 多聚-L-赖氨酸包被2小时。 以三蒸水冲洗干燥后待用;孕15 ~17 天ICR 小鼠,常规麻醉消毒,剪开腹部皮肤及腹膜,取出胎鼠,放入预冷的DMEM 基础培养基中;将其放置于解剖显微镜下缓慢剥离胎鼠的头部皮肤与颅骨,暴露两侧大脑半球,用解剖镊小心分离并取出双侧皮层,轻轻剔除血管和脑膜组织,置于含预冷DMEM 基础培养基的6 cm 的培养皿中;将上述组织块移入至15 mL 离心管中,用1 mL 枪轻轻吹打使皮层成碎片,1500 r/分钟,离心5 分钟;去上清,加5 mL 0.25%胰蛋白酶和100 μL DNA 酶 I,在37℃水浴箱中作用15 ~20 分钟,其间振荡2 ~3次,当消化液混浊、不含有组织块时,加含10%FBS和10%HS 的DMEM/F12 培养基终止;将细胞悬液用70 目细胞筛过滤后,1500 r/分钟,离心5 分钟;弃上清,沉淀物中加入神经元接种培养基,台盼蓝染色,细胞计数板计数,以1×105/mL 的密度将细胞种植于培养板中,然后置于37℃、5% 的CO2培养箱中培养;4 小时细胞贴壁后,换神经元维持培养基,以后每周2 ~3次半量换液。

1.3.2 SY5Y 细胞培养 SY5Y 细胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基中,在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养,每隔2 ~3 天传代1 次。

1.3.3 SC8 细胞培养 SC8 细胞是U2OS 细胞稳定转染的βarr2-GFP 和 Smothened-633(Smo-633)的细胞系。 SC8 细胞置于含10%胎牛血清和抗生素(含100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素)的 MEM 培养基中,在37℃、5% CO2 的恒温培养箱中培养,每隔2 ~3 天传代1 次。

1.4 CCK-8 检测原代神经元细胞和SY5Y 细胞存活率

1.4.1 原代神经元细胞存活率 原代神经元细胞以1×105/mL 的密度接种于96 孔板,每孔100 μL,培养7 天进行实验,显微镜下观察神经元之间形成神经网络。 实验分为对照组、AAPH 组和AAPH+血栓通注射液组。 AAPH 组AAPH 浓度为20 mmol/L;AAPH+血栓通注射液组AAPH 浓度为20 mmol/L,血栓通注射液浓度分别为 0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL;对照组加同等体积的正常培养基,每组3 个复孔。 置入 37℃、5%CO2培养箱培养4 小时后,每孔加10 μL CCK-8 试剂,在 37℃孵育4 小时,用酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的光密度,3 个复孔取平均值,计算细胞存活率。 实验重复3 次。 细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%[注:As:实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8);Ac:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8);Ab:空白孔(不含细胞和CCK-8)]。 实验分为对照组、OGD 组和血栓通注射液组,对照组神经元培养基换成含糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2孵箱中常氧培养,OGD 组神经元培养基换成无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 血栓通注射液组,培养基换成含 0.25、0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 培养20 小时后,CCK-8 检测原代神经元存活率,检测方法同上。

1.4.2 SY5Y 细胞存活率 收集对数期生长的SY5Y 细胞接种于 96 孔板,100 μL/孔(约 2×105/mL),置 37℃,5% CO2细胞培养箱培养过夜。 将SY5Y 细胞分为对照组、AAPH 组和AAPH+血栓通注射液组。 AAPH 组 AAPH 浓度为 20 mmol/L。AAPH+血栓通注射液组AAPH 浓度为20 mmol/L,血栓通注射液浓度分别为0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、 1、2 mg/mL。 对照组加同等体积的正常培养基,每组3 个复孔。 置入37℃、5%CO2培养箱培养6 小时后,CCK-8 检测SY5Y 细胞存活率,检测方法同原代神经元的检测。

1.5 实时定量RT-PCR 的方法检测Gli1 的表达

原代神经元细胞以1×105/mL 的密度接种于6孔板上,每孔2 mL,培养至第7 天进行实验。 实验分为对照组、SAG 组、cyclopamine 组、血栓通注射液组、SAG+cyclopamine 组和SAG+血栓通注射液组。对照组神经元培养基换成无糖Earle's 缓冲液,于37℃ 、5%CO2低氧孵箱中 1% O2培养。 SAG 组,培养基换成含 0.05、0.1、0.25 μmmol/L SAG 的无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 cyclopamine 组,培养基换成含 2 μmmol/L cyclopamine 的无糖 Earle's 缓冲液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中1% O2培养。 血栓通注射液组,培养基换成含 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 SAG+cyclopamine 组,换成同时含 0.05、0.1 μmmol/LSAG 和含 2 μmmol/L cyclopamine 的无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 SAG+血栓通注射液组,换成同时含0.05、0.1 μmmol/L SAG 和含 2 mg/mL 血栓通注射液的无糖Earle's 缓冲液,于 37℃、5% CO2低氧孵箱中1%O2培养。 Trizol 法提取 RNA,用实时定量 PCR 仪检测神经元中Gli1 的表达。

1.6 共聚焦显微镜观察SC8 细胞中βarr2-GFP 的分布情况

将 SC8 细胞分为 4 组:对照组、SAG 组、cyclopamine组和血栓通注射液组。 对照组将培养基换成无糖Earle's 缓冲液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培养。 SAG 组,培养基换成含 0.25 μmmol/L SAG 的无糖 Earle's 缓冲液,于 37℃ 、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 cyclopamine 组,培养基换成含2 μmmol/L cyclopamine 的无糖 Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培养。 血栓通注射液组,培养基换成含2 mg/mL 血栓通注射液的无糖Earle's 缓冲液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培养。 20 小时后,随机选取多个视野,激光共聚焦显微镜观察SC8 细胞中βarr2-GFP 的分布情况。

1.7 统计学处理

所有数据采用SPSS17.0 软件进行分析处理。本研究计量资料经检验均符合正态分布且方差齐,以均数±标准差()表示,数据采用t检验,组间比较用配对t检验,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血栓通注射液对AAPH 造成SY5Y 细胞损伤的影响

AAPH 作为一个氧自由基诱发剂,可诱导氧化应激反应。 当20 mmol/L AAPH 作用SY5Y 细胞6小时后,与对照组相比,SY5Y 细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了AAPH 造成的SY5Y 细胞的损伤,其中血栓通注射液浓度为 0.015625、0.03125、0.0625、0.125 mg/mL 时,细胞存活率与AAPH 组比较无统计学意义(P>0.05)。 当血栓通注射液浓度为0.25、0.5、1、2 mg/mL 时,细胞存活率下降,与 AAPH 组比较有统计学差异(P<0.01)。 见表1。

表1 不同浓度血栓通注射液对AAPH 造成SY5Y 细胞损伤的影响()

表1 不同浓度血栓通注射液对AAPH 造成SY5Y 细胞损伤的影响()

注: 与对照组比较,aP<0.01;与AAPH 组比较,bP<0.01。

组别 n 细胞存活率(%)3 1.00±0.03 AAPH 组 3 0.52±0.04a AAPH+血栓通注射液(0.015625 mg/mL)组 3 0.50±0.07 AAPH+血栓通注射液(0.03125 mg/mL)组 3 0.46±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.0625 mg/mL)组 3 0.48±0.04 AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)组 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)组 3 0.32±0.03b AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)组 3 0.29±0.03b AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)组 3 0.22±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)组 3 0.14±0.02对照组b

2.2 血栓通注射液对AAPH 造成神经元损伤的影响

当20 mmol/L AAPH 作用神经元4 小时后,与正常对照组相比,神经元存活率下降,差异有统计学意义(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重AAPH 造成神经元损伤,其中血栓通注射液浓度为0.125、0.25、0.5 mg/mL 时,神经元存活率与 AAPH组比较无统计学意义(P>0.05)。 当血栓通注射液浓度为1、2 mg/mL 时,神经元存活率下降至(0.29±0.06)、(0.16±0.06),与 AAPH 组比较有统计学差异(P<0.01)。 见表 2。

表2 不同浓度血栓通注射液对AAPH造成神经元损伤的影响()

表2 不同浓度血栓通注射液对AAPH造成神经元损伤的影响()

注: 与对照组比较,aP<0.01;与AAPH 组比较,bP<0.05,cP<0.01。

组别 n 细胞存活率(%)3 1.00±0.02 AAPH 组 3 0.40±0.07a AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)组 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)组 3 0.45±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)组 3 0.41±0.04 AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)组 3 0.29±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)组 3 0.16±0.06对照组c

2.3 血栓通注射液对低氧条件下神经元的存活率的影响

神经元的存活率降至(0.76±0.03), 较对照组明显下降(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了神经元的损伤,当血栓通注射液浓度为0.5、1、2 mg/mL时,神经元的存活率分别为(0.67±0.02)、(0.57±0.03)、(0.53±0.04),与 OGD 组相比均有统计学差异(P<0.01)。 PSN 可加重低氧条件下神经元的损伤,且呈剂量依赖性,随着血栓通注射液浓度的增加,神经元的存活率降低更加明显。 见表3。

表3 不同浓度下血栓通注射液对低氧条件下神经元存活率的影响()

表3 不同浓度下血栓通注射液对低氧条件下神经元存活率的影响()

注: 与对照组比较,aP<0.01;与OGD 组比较,bP<0.01。

组别 n 细胞存活率(%)3 1.00±0.02 OGD 组 3 0.76±0.03a OGD+血栓通注射液(0.25 mg/mL)组 3 0.72±0.03 OGD+血栓通注射液(0.5 mg/mL)组 3 0.67±0.02b OGD+血栓通注射液(1 mg/mL)组 3 0.57±0.03b OGD+血栓通注射液(2 mg/mL)组 3 0.53±0.04对照组b

2.4 血栓通注射液对低氧条件下神经元Gli1 表达的影响

在低氧环境中,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1表达明显升高(P<0.01),与对照组比较增加(3.56±0.65 ) 倍。 Hedgehog 通 路 的 抑 制 剂cyclopamine可使Gli1 表达量下降,当cyclopamine 浓度为 2 μmmol/L 时,Gli1 表达量下降至(0.14±0.03)倍。 同样发现 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液也可抑制 Gli1 的表达,Gli1 表达量分别下降至(0.30±0.08)、(0.16±0.04)、(0.15±0.03)倍,与cyclopamine 作用一致。 见表 4。

表4 不同浓度血栓通注射液对低氧条件下神经元Gli1 的表达的影响()

表4 不同浓度血栓通注射液对低氧条件下神经元Gli1 的表达的影响()

注: 与对照组比较,aP<0.01。

3 1.00±0.04 SAG 组 3 3.56±0.65a Cyclopamine 组 3 0.14±0.03a血栓通注射液(0.5 mg/mL)组 3 0.30±0.08a血栓通注射液(1 mg/mL)组 3 0.16±0.04a血栓通注射液(2 mg/mL)组 3 0.15±0.03水平对照组组别 n Gli1 a

2.5 血栓通注射液对低氧条件下SAG 导致的Gli1表达升高的影响

0.05 和 0.1 μmmol/L SAG 均可增加 Gli1 的表达,分别为(3.09±0.31)倍和(5.75±0.68)倍(P均<0.01),0.1 μmmol/L SAG 组 Gli1 增加更明显。 2 mg/mL 血 栓 通 注 射 液 和 2 μ mmol/L cyclopamine 均可降低Gli1 的表达,分别降至(0.19±0.06)倍和(0.08±0.01)倍(P均<0.01),结果与前面实验结果一致。 然而,当SAG 和血栓通注射液或cyclopamine 同时作用神经元时,发现血栓通注射液可抑制SAG 诱导的的Gli1 表达增加,血栓通注射液使0.1 μmmol/L SAG 组 Gli1 增加(5.75±0.68)倍降至增加(2.56±0.35)倍,使 0.05 μmmol/L SAG 组Gli1 增加(3.09±0.31)倍降至增加(1.7±0.21)倍(P均<0.01),作用与 cyclopamine 相似。 见表 5。

表5 血栓通注射液对低氧条件下SAG 导致的Gli1 表达升高的影响()

表5 血栓通注射液对低氧条件下SAG 导致的Gli1 表达升高的影响()

注: 与对照组比较,a P<0.01;与 SAG(0.1 μmmol/L)组比较,bP<0.01;与 SAG(0.05 μmmol/L)组比较,cP<0.01。

3 1.00±0.04 Cyclopamine 组 3 0.08±0.01a血栓通注射液组 3 0.19±0.06a SAG(0.1 μmmol/L)组 3 5.75±0.68a SAG(0.1 μmmol/L)组+Cyclopamine 组 3 2.23±0.38b SAG(0.1 μmmol/L)组+血栓通注射液组 3 2.56±0.35b SAG(0.05 μmmol/L)组 3 3.09±0.31a SAG(0.05 μmmol/L)组+Cyclopamine 组 3 1.95±0.23c SAG(0.05 μmmol/L)组+血栓通注射液组 3 1.71±0.21水平对照组组别 n Gli1 c

2.6 血栓通注射液对Smothened 的影响

根据激光共聚焦显微镜观察SC8 细胞中βarr2-GFP 的分布情况,判断血栓通注射液对Smothened(Smo)的作用。 对照组βarr2-GFP 呈点状聚集分布在细胞质(图 1A)。 当 2 μmmol/L cyclopamine 作用SC8 细胞时,βarr2-GFP 的分布发生变化,在细胞质呈现均匀分布(图1B)。 2 mg/mL 血栓通注射液处理SC8 细胞,βarr2-GFP 仍呈点状聚集分布在细胞质(图1C)。

图1 激光共聚焦显微镜观察SC8细胞中βarr2-GFP 的分布情况

3 讨论

脑卒中是由脑血管病变引起的脑部疾病的总称,故又称为“脑血管病”。 脑缺血再灌注损伤是脑卒中很重要的病理生理过程,再灌注损伤主要是通过引起自由基过度产生及其“瀑布式”连锁反应等一系列氧化应激变化,导致细胞内大分子如核酸、脂质、蛋白质等的氧化损伤,从而引起神经细胞死亡[6-7]。

AAPH 作为一个氧自由基引发剂,可以诱导细胞内氧化损伤,产生各种病理变化,在氧化应激疾病模型中广泛应用[8-9]。 目前研究脑卒中的方法主要有体内大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)和体外 OGD[10-11]。 如 MO ZT[11]以PC12 细胞OGD 为模型,模拟脑卒中,并探索石菖蒲提取物β-细辛脑对细胞自噬的作用等。 本研究以AAPH 作用造成氧化应激损伤及OGD 处理模拟体外缺血性脑卒中状态。 AAPH 可造成SY5Y 细胞及神经元损伤;神经元经OGD 处理20 小时后,神经元的存活率较正常对照组明显下降(P<0.01)。 这与缺血性脑卒中后神经细胞受损结果一致。

课题组还发现,血栓通注射液可加重AAPH造成的SY5Y 细胞及神经元细胞损伤;且血栓通注射液降低低氧条件下神经元的存活率,当血栓通注射液 浓度为 0.5、1、 2 mg/mL 时,与 OGD 组相比各组均(P<0.01),且呈剂量依赖性。 血栓通注射液是中药血栓通的主要成分,血栓通的主要成分为血栓通注射液,包含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷 R1 等。 在 MCAO 造成的大鼠脑梗死模型中,血栓通注射液能明显改善脑功能,改善脑血管渗漏,减少脑组织内炎性细胞浸润,对大鼠脑微血管内皮细胞进行OGD 处理,发现血栓通注射液可降低TNF-α、IL-8 及RIG-I 受体通路调控的下游细胞因子水平,血栓通注射液可能是通过RIG-I 信号通路发挥脑缺血时抗炎作用[12]。 HU SN 等[13]发现三七皂苷可通过激活PI3K/Akt/Nrf2通路,从而保护脑微血管内皮细胞因缺血再灌注诱导的血脑屏障破坏。 但是,部分学者对血栓通注射液的细胞保护作用持有相反意见。 在探索血栓通注射液对脑出血大鼠脑水肿超早期影响的研究[2]中发现,较脑出血模型组,血栓通注射液可加重大鼠神经缺损症状,增加脑含水量及钠离子含量,说明血栓通注射液治疗超早期脑出血,可加剧脑水肿,加重大鼠神经功能缺损症状。 LI SY等[14]研究发现,人参皂苷Rd 本身对BASMCs 细胞无毒性作用,但可加重H2O2造成BASMCs 细胞存活率的下降,并且呈现浓度依赖性。 H2O2作用BASMCs 细胞后,早期凋亡率为(20.9±3.8)%,10 μmmol/L人参皂苷 Rd 预处理 30 分钟,细胞凋亡率下降到(31.5±3.6)%,人参皂苷可加重H2O2造成的促凋亡蛋白Bax 的增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的降低和Bcl-2/Bax 比率的降低,增加细胞色素C的释放和caspase-9/caspase-3 激活,并降低线粒体膜电位的稳定性。

近年来,Shh 通路在缺血性脑病的研究中越来越多。 Shh 通路通过上调紧密连接(TJ)蛋白促进血脑屏障完整性,对卒中后血脑屏障破坏产生保护作用[15]。 ZHANG J 等[16]发现 SD 大鼠经过 MCAO后,立即给予侧脑室注射 Shh 通路抑制剂cyclopamine,24 小时后与对照组比较,cyclopamine组Gli1、Ptch1 与SOD1 表达下降,梗死面积增加,脑水肿明显,神经行为缺损加重。 这些数据表明,抑制Shh 通路后,加重脑卒中的神经损伤。 在本实验中,发现血栓通注射液可以抑制神经元OGD 后Gli1 的表达。 SAG 是 Shh 通路 Smo 的激活剂,可使 Gli1 表达升高,cyclopamine 是Smo 的抑制剂,可使Gli1 表达下降,因此选用SAG 和cyclopamine 作为本实验的阳性对照药物。 神经元经过OGD 处理后,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1 表达明显升高(P<0.01),2 μmmol/L cyclopamine 可使 Gli1 表达量下降,0.5、1、2 mg/mL血栓通注射液也可抑制Gli1 的表达,与cyclopamine作用一致。 并且,经过进一步研究,课题组发现血栓通注射液可抑制 SAG 导致的 Gli1 的升高。 当SAG 和血栓通注射液或cyclopamine同时作用神经元时,发现血栓通注射液可抑制SAG 诱导的的Gli1 表达增加,作用与cyclopamine 相似。

Smo 受体激动剂具有保护神经和促进缺血性脑损伤后再生的作用[17]。 Smo 激活后对G 蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)信号通路有重要作用,它可以磷酸化GPCR,招募βarr2 蛋白聚集,发挥内吞作用[18]。 在正常情况下,βarr2 均匀分布于细胞质中,当 Smo 或者 Smo-633 过表达时,βarr2 在细胞质中发生点状聚集,经过cyclopamine处理后,βarr2 又重新均匀分布于细胞质中[18]。 课题组发现,SC8 细胞中由于Smo-633 过表达,βarr2-GFP 呈点状聚集分布在细胞质,给予cyclopamine 处理,发现βarr2-GFP 均匀分布于细胞质中,与之前研究相似。 为了验证血栓通注射液是否通过Smo 抑制Gli1 的降低,故用血栓通注射液作用SC8 细胞,发现血栓通注射液组,βarr2-GFP 呈点状聚集分布在细胞质,说明血栓通注射液不能抑制Smo,可能抑制Smo 下游信号分子。

综上所述,血栓通注射液加重体外低氧后神经元的损伤,可能通过抑制Hedgehog 通路发挥作用,血栓通注射液抑制低氧条件SAG 导致的Gli1 表达升高,而不影响Smo,说明其可能通过抑制Smo 下游因子来抑制Gli 的表达。 因此,中药血栓通注射液应用于脑血管病的治疗时要“辨证论治”,依据中医理论和中药药理学辨证选药,科学、规范、系统地治疗脑血管病。 本实验亦有不足之处,体外低氧状态模拟脑卒中有一定的局限性,需进一步的验证。