张鹏博,张 沅,李冰滢,谢 欢,李 鑫,陈 芳,农蔚霞,,罗 彬,,,谢小薰,,,张庆梅,,(山西省运城市中心医院神经外二科,运城 0000;广西医科大学组织学与胚胎学教研室;广西医科大学基础医学研究重点实验室;广西医科大学长寿与老年相关疾病教育部重点实验室;通讯作者,E-mail:90785@qq.com)

胶质瘤是一种常见的原发性神经上皮肿瘤，约占中枢神经系统所有肿瘤的35%，占成人原发性恶性脑肿瘤的75%[1]，目前其常规治疗主要包括手术切除、替莫唑胺(TMZ)化疗和放疗，但这些还远不能达到对胶质瘤的完全治愈，只能作为缓解其发展的手段[2]，迫切需求寻找新的治疗手段。肿瘤免疫疗法是一种新型的治疗方法，其主要目的是提高抗肿瘤免疫反应，比化疗等直接杀死癌细胞的药物脱靶效应小，肿瘤免疫治疗的主要障碍之一是确定最适合使用的肿瘤靶抗原。

黑色素瘤抗原基因(melanoma-associated antigen genes, MAGE)是近年来发展迅速的肿瘤分子靶点，1991年Bruggen等[3]发现MZ2-E(现称为MAGE-A1)是一个编码肿瘤特异性抗原的基因，此后根据基因结构和组织特异性基因表达的差异，已经鉴定出80多个MAGE基因，并将其分为Ⅰ型和Ⅱ型基因。与Ⅰ型基因相比，Ⅱ型MAGE-D基因具有更复杂的基因组结构，具有一个由多个外显子编码的开放阅读框。MAGE-D4属于MAGE-Ⅱ家族，已经有多项研究发现MAGE-D4在胶质瘤中特异性表达,并且其表达水平相比正常脑组织呈现过表达[4,5]，提示MAGE-D4可能在胶质瘤中是肿瘤特异性抗原。

本课题组前期通过沉默胶质瘤细胞株中MAGE-D4的表达，显示其可抑制胶质瘤细胞株的恶性生物学行为[6]，并进一步通过RNA-Seq高通量测序，观察到沉默MAGE-D4的表达可引起微小染色体维持蛋白3(minichromosome maintenance 3，MCM3)的表达明显下降。为了分析MAGE-D4和MCM3在胶质瘤中的关联性及其临床意义，本研究采用了基因表达谱交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库、癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、中国脑胶质瘤基因组图谱计划(The Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)、逆转录-定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术相结合的方式分析MAGE-D4和MCM3在胶质瘤组织及细胞中的表达水平，及其临床意义和相关性，探索二者是否共同参与了胶质瘤的发生、发展。

1 材料与方法

1.1 在线数据库分析

采用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn)分析MAGE-D4和MCM3 mRNA在胶质瘤和正常脑组织中的表达，其中包括低级别胶质瘤518例，胶质母细胞瘤163例和正常脑组织207例；此外，分别下载TCGA及CGGA数据库中675例及326例胶质瘤中MAGE-D4和MCM3 mRNA的生存资料，分析MAGE-D4和MCM3 mRNA的表达情况与患者预后总体生存率的相关性。

1.2 临床资料与组织标本

本研究方案经广西医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准，纳入本研究的所有患者均获得书面知情同意。收集2009-2018年广西医科大学附属第一医院神经外科住院患者并接受手术治疗的脑胶质患者组织标本62例和正常脑组织标本11例。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类中低胶质瘤分类，Ⅰ级12例，Ⅱ级26例，Ⅲ级12例，Ⅳ级12例。将Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤归为低级别胶质瘤(low-grade gliomas, LGG)，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤归为高级别胶质瘤(high-grade gliomas, HGG)。病理检查结果：星型细胞瘤41例，胶质母细胞瘤(GBM)12例，少突胶质细胞瘤5例，室管膜瘤4例。所有胶质瘤患者在术前均未接受放疗及化疗。作为阴性对照的正常脑组织标本11例，来自于脑外伤后去骨瓣减压过程中去除的正常脑组织。胶质瘤标本选取肿瘤中心组织，尽量避开出血及坏死部位，离体后立即置入液氮罐中并迅速转运到-80 ℃冰箱保存。通过医院病历系统收集胶质瘤患者的一般临床资料及病理检查结果。

1.3 主要试剂

人脑胶质瘤细胞株U251和SF126均购自中国科学院上海细胞培养库，培养细胞所用的胎牛血清、青-链霉素混合液、MEM-EBSS培养基及DMEM培养基均购于南京维森特生物技术有限公司，转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Thermo Fisher Scientific公司，RNA提取试剂盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR试剂盒购自美国Vazyme公司，超微量分光光度计购自天根生化科技有限公司，LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪购自Roche公司,siRNA由上海吉玛基因股份有限公司合成。

1.4 细胞培养

人脑胶质瘤细胞株U251和SF126培养于DMEM、MEM-EBSS培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/L链霉素)中；培养条件为37 ℃，5%CO2。

1.5 细胞转染

于6孔板中以3×105个/孔的细胞密度接种SF126及U251，37 ℃，5%CO2培养24 h，待融合度约70%时，开始进行转染。转染时首先将siRNA和转染试剂LipofectamineTM3000混合形成转染复合物，接着更换无血清培养基，并将静置15 min，将转染复合物加入6孔板中，混匀后置于细胞培养箱继续培养24～72 h，培养完成后收集细胞进行沉默效率及最佳干扰时间检测实验，沉默效率实验采用RT-qPCR对转染前后细胞(U251，SF126)检测MAGE-D4的表达，并计算沉默效率及最贱干扰时间。干扰MAGE-D4表达的siRNA和阴性对照siRNA(靶基因MAGE-D4的无关序列)的序列为：MAGE-D4 siRNA Sense:5′-GUGCAAUCGGAAAGCUACATT-3′,Antisense:5′-UGUAGCUUUCCGAUUGCACGC-3′;阴性对照siRNA Sense:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,Antisense:5′-CGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.6 RT-qPCR检测MAGE-D4和MCM3 mRNA的表达

按照细胞/组织总RNA提取试剂盒说明书提取组织标本和胶质瘤细胞株总 RNA,接着利用超微量分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测上述提取RNA的浓度、纯度及完整性；确定RNA完整无降解后，采用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA，得到的cDNA首先经过扩增管家基因检测质量，采用LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪进行扩增，以GAPDH为内参对照，每个样品重复3个孔，整体实验重复3次；上述反应体系为：SYBR Green Ⅰ Master 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl；反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；MAGE-D4、MCM3和GAPDH引物序列分别见参考文献[7,8]。采用2-ΔΔCt法计算目的基因MAGED4和MCM3相对表达水平。RT-qPCR引物见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.7 统计学分析

上述MAGE-D4和MCM3的表达是以其mRNA的中位数将其分为高表达组和低表达组，并应用SPSS 27.0统计分析软件进行数据分析，其中多组间的比较使用单因素方差分析，以SNK检验进行组间两两比较；MAGE-D4和MCM3 mRNA表达与临床病理特征之间的关系使用卡方检验(Chi-square test)；表达相关性分析采用Pearson相关系数法，以P<0.05为差异有统计学意义，以上统计分析采用Graphpad Prism 9.0作图。

2 结果

2.1 胶质瘤中MAGE-D4和MCM3的表达

GEPIA数据库查询结果显示：与正常脑组织相比，MAGE-D4和MCM3 mRNA无论在低级别胶质瘤还是高级别胶质瘤组织中均呈高表达(P<0.05，见图1)。检测本实验室所收集的62例胶质瘤样本，RT-qPCR结果证实:胶质瘤组织中MAGE-D4表达为正常脑组织的3.95倍，且差异具有统计学意义(t=2.989,P=0.004<0.05)；胶质瘤组织中MCM3表达为正常脑组织的3.49倍，且差异具有统计学意义(t=2.294,P=0.025<0.05，见图2)。

与正常脑组织比较,*P<0.05图1 GEPIA数据库中不同组织MAGE-D4和MCM3 mRNA的表达水平比较Figure 1 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels in different tissues in GEPIA database

与正常脑组织比较,*P<0.05,**P<0.01图2 脑胶质瘤组织与正常脑组织MAGE-D4和MCM3 mRNA表达水平比较Figure 2 Comparison of MAGE-D4 and MCM3 mRNA expression levels between glioma tissue and normal brain tissue

2.2 胶质瘤患者MAGE-D4和MCM3的生存分析

通过TCGA数据库查询显示：MAGE-D4及MCM3在总体胶质瘤中表达与总体生存率明显相关(P<0.001，见图3)；接着通过在CGGA数据库中查询显示：MAGE-D4在原发胶质瘤中的表达与总体生存率密切相关(P<0.05)，而在复发胶质瘤中MAGE-D4表达与总体生存率无明显相关性；MCM3在原发及复发胶质瘤中均与总体生存率明显相关(P<0.001，见图4)。

图3 TCGA数据库中不同MAGE-D4和MCM3表达胶质瘤患者的生存分析Figure 3 Survival analysis of glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 expression in TCGA database

图4 CGGA数据库中不同MAGE-D4和MCM3表达的原发胶质瘤和复发胶质瘤患者的生存分析Figure 4 Survival analysis of primary and recurrent glioma patients with different MAGE-D4 and MCM3 in CGGA database

2.3 MAGE-D4和MCM3表达与胶质瘤患者临床指标的关系

为了解MAGE-D4和MCM3在胶质瘤组织中表达的临床意义，将MAGE-D4及MCM3 mRNA与胶质瘤患者临床指标的关系进行统计分析，结果显示：MAGE-D4及MCM3 mRNA的表达水平与患者年龄、性别、WHO分级、病理类型、卡氏评分(Karnofsky performance score, KPS)、肿瘤大小及Ki-67、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、S-100和波形蛋白(vimentin)表达均无相关性(P>0.05，见表2)。

表2 MAGE-D4及MCM3 mRNA表达情况与胶质瘤患者临床指标的关联性分析结果 例(%)Table 2 Correlation between mRNA expression of MAGE-D4 and MCM3 and clinical indicators of glioma patients cases(%)

2.4 胶质瘤组织MAGE-D4与MCM3 mRNA表达相关性分析

Pearson相关分析结果显示，所检测的胶质瘤组织中MAGE-D4与MCM3 mRNA表达水平呈正相关(r=0.075 51，P=0.030 7，见图5)。

图5 胶质瘤样本中MAGE-D4和MCM3的相关性分析Figure 5 Correlation between MAGE-D4 mRNA and MCM3 mRNA in glioma samples

2.5 胶质瘤细胞株沉默MAGE-D4表达对MCM3表达的影响

细胞实验结果显示，经MAGE-D4 siRNA沉默后,SF126细胞中沉默效率为57%，而且MCM3 mRNA的表达水平较沉默前显著下降(P<0.05，见图6)；U251细胞经MAGE-D4 siRNA沉默后，沉默效率为83%，MCM3 mRNA的表达水平同样显著下降(P<0.05，见图6)。

与MOCK组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图6 胶质瘤细胞株沉默MAGE-D4表达后MCM3的表达Figure 6 Expression of MCM3 in glioma cell lines after silencing MAGE-D4 expression

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其包括多种组织学类型，如星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和胶质母细胞瘤(GBM)，根据WHO分类可进一步分为4个级别。WHO Ⅰ和Ⅱ分级为生长缓慢且预后较好的病灶，也称为低级别胶质瘤；而WHO Ⅲ级和Ⅳ级通常被认为是高级别胶质瘤，具有侵袭性行为和不良预后[9-11]。目前来说，癌症免疫治疗可以成为胶质瘤治疗的一种新的方向，其可通过操纵免疫系统实现肿瘤的长期缓解，且副作用最小。筛选肿瘤特异性抗原正是开展肿瘤免疫治疗的基础。

MAGE家族是目前来说研究进展较快的一类肿瘤相关抗原，目前来说，有许多MAGE家族成员已被深入研究，并认为是理想的肿瘤靶抗原，如MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A9等已在某些肿瘤中进入临床试验阶段，并呈现出相对良好的疗效[12,13]。因此，MAGE家族具有重大研究价值，本文中的MAGE-D4已有多项研究证实其在肺癌[14,15]、肝癌[16,17]、乳腺癌[18]等多种类型的肿瘤中高表达，并且有实验已经开始对MAGE-D4进行多克隆抗体的制备[19]。有研究表明MAGE-D4表达下调可引起P53突变型胶质瘤细胞系的细胞周期S期和G2/M期细胞比例增加，表明MAGE-D4对细胞周期的影响可能依赖于P53[6]。本研究通过GEPIA数据库数据及临床实验数据证实MAGE-D4在胶质瘤组织中呈高表达，而在正常脑组织中低表达或不表达，这与相关文献报道结果相似[4,6]，并且通过CGGA及TCGA数据库证实了MAGE-D4的表达与总体生存率有明显的相关性，这些提示MAGE-D4在胶质瘤的发生发展过程中可能发挥重要作用。

肿瘤的发生及发展离不开体内、体外各种因素及多种基因间的相互作用。为了寻找与MAGE-D4相互作用的各种基因分子，本课题组前期通过RNA-seq高通量测序筛选发现了MCM3[20]。目前已知MCM3属于微小染色体维持蛋白的一员。MCM3编码808个氨基酸的核蛋白，分子量为105 kD[21,22]。以前的研究表明，MCMs蛋白复合物与DNA复制的起始和延伸有关[23]，MCMs被认为是细胞周期S期的特殊启动标志蛋白，其可以在不同的细胞周期中大量表达，并在静止、衰老和分化步骤中降解，因此MCMs可以用作组织中细胞周期状态的特定标记蛋白[24]。MCMs基因在增殖细胞中的这一特征已导致其潜在的临床应用作为癌症筛查的标志物。有研究表明，MCM3s是一种P53结合蛋白[25]。同时有文献指出，MCM3在多种肿瘤中过度表达,如肾细胞癌[26]、子宫内膜癌[27]、乳腺癌[28]、髓母细胞瘤[29]、恶性黑色素瘤[30]等。但MCM3在胶质瘤中的表达情况和作用机制国内外文献研究并不多。本研究首先通过GEPIA数据库数据及临床实验检测证实MCM3在胶质瘤中高表达，接着通过CGGA及TCGA数据库证实了MCM3的表达与总体生存率有明显的相关性，这与文献的研究结果类似[31,32]。但令人遗憾的是本研究结果并未观察到MAGE-D4和MCM3 mRNA与胶质瘤患者临床指标存在相关性，可能的原因有标本例数有限、临床资料不够完善等，可扩充样本进一步实验。

Pearson相关分析结果显示，MAGE-D4与MCM3 mRNA表达水平呈正相关，差异具有统计学意义，并且沉默MAGE-D4 mRNA在胶质瘤细胞中的表达后，MCM3 mRNA表达水平随之显著下降，这提示MAGE-D4可能与MCM3之间存在相互作用，综合上述结果及文献分析，猜测MGGE-D4与MCM3可能通过p53信号通路共同参与对细胞周期的调节，从而参与了胶质瘤的发生、发展。

综上所述，MAGE-D4和MCM3在胶质瘤组织中呈高表达，且二者表达水平呈正相关，可能共同参与了胶质瘤的发生、发展过程。MAGE-D4和MCM3具有成为胶质瘤免疫治疗新靶点的潜力。