方春凤 潘静巧 李丹英 狄朋桃

（1.云南中医药大学第一附属医院/云南省中医医院儿科，云南 昆明 650021；2.楚雄州中医医院/云南省彝医医院儿科，云南 楚雄 675000；3.玉溪市人民医院神经外科，云南 玉溪 653300；4.云南中医药大学第一附属医院/云南省中医医院风湿科，云南 昆明 650021）

抽动障碍（Ticdisorder，TD），是起病于儿童和青少年时期，主要表现为不自主的、反复的、快速的、突发的一个或多个部位肌肉运动抽动，伴或不伴发声抽动的综合征，并可伴有注意力不集中、多动、强迫动作和思维以及其他行为症状[1]。TD病因和发病机制尚不明确，但诸多实验表明，TD发病主要与多巴胺（Dopamine，DA）、去甲肾上腺素（Nor epinepherine，NE）、肾上腺素（Epinepherine，E）等胺类物质的改变有关[2]。在体内E和NE及NE的前体DA通过儿茶酚-O-位甲基转换酶（Cat echol-O-methyl transferase，COMT）及单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）的作用而灭活。孙锦华等[3]研究发现COMT基因Val 158met多态性与抽动障碍，尤其是共患注意缺陷多动障碍的发病有关。MAO因其代谢底物不同分为A型和B型，在纹状体内DA的代谢主要依靠MAO-B，而MAO-A的作用仅占20%[4]。Teo K C等[5]在研究MAO-B抑制剂治疗帕金森时发现MAO-B可以代谢大脑中的多巴胺。可见COMT和MAO-B可通过降解E、NE、DA等胺类神经递质而影响抽动障碍的发生发展。

多巴胺通过与神经元细胞膜上的相应受体结合发挥功能。多巴胺受体（Dopamine receptor DR）根据其结构和理化性质的差异分为D1类受体（包括D1和D5受体）和D2类受体（包括D2、D3和D4受体）[6]。STEEVES T D L等[7]研究发现，多巴胺能神经细胞突触后多巴胺受体D1（DRD1）亲和力升高与TD发病有关。另有研究发现，抽动障碍患者纹状体内多巴胺受体D2（DRD2）的含量与内源性多巴胺的水平呈负相关[8]。上述研究提示TD患者脑内多巴胺受体D1表达升高，而D2受体降低。

本实验旨在观察针刺治疗对亚氨基二丙腈（Iminodipropionitrile，IDPN）诱导的抽动障碍大鼠模型脑内COMT、MAO-B、DRD1、DRD2表达的影响，以探讨针刺治疗抽动障碍可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（160±20）g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SYXK（滇）K2013-008。实验在云南省高校中医药分子生物学重点实验室实施，饲料和饮用水消毒后由动物自由摄取。

1.2 实验试剂与药物 总RNA提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司，批号：B518651）；PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRa公司，批号：DRR036A）；SYBR Premix Ex TaqⅡ（日本TaKaRa公司，批号：DRR820A）；β-actin内参引物（上海生工生物工程有限公司）。引物合成，上海生工生物工程有限公司。IDPN（Sigma-Aldrich中国，批号：317306）；氟哌啶醇片（宁波大红鹰药业股份有限公司，国药准字H33020585）。

1.3 实验仪器 水平电泳仪（美国BIO-RAD公司）；CTK150R型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Nano-600+超微量核酸蛋白检测仪（北京众力挽生物科技有限公司）；ABI 7900 PCR仪（美国ABI公司）；0.25 mm×13 mm针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 抽动模型制备 动物购进饲养于SPF级动物实验室，温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h明暗循环，随机分为4组，每组10只，分别标注为空白组、模型组、针刺治疗组和对照组。适应性饲养7 d后进行实验，饲料和饮用水消毒后由动物自由摄取。模型制备当日，除空白组外，亚氨基二丙腈（IDPN）溶解于生理盐水，稀释成浓度为35 mg/mL溶液，腹腔注射，剂量为350 mg/（kg·d）。

1.4.2 治疗方法 针刺大鼠百会、合谷、内关和大椎穴，平针法，与皮肤呈15°夹角进针，每日1次，每次留针30 min，以40下/min捻针3次，每连续治疗5 d，休息2 d，总疗程4周。对照组予氟哌啶醇片（宁波大红鹰药业股份有限公司，国药准字H33020585）2 mg/d，按临床等效剂量法换算，大鼠剂量0.67 mg/（kg·d）。氟哌啶醇片研末溶于蒸馏水灌胃给药，模型组和空白组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，治疗4周，治疗结束后取脑组织检测。

1.4.3 组织检测 实验结束，取脑组织50～100㎎，用液氮冰冻后将组织块研磨成粉末，再移入离心管反复震荡、冰敷、离心。把焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水加入离心管，使RNA溶解析出组织外，液氮保存。将提取的RNA置于核酸蛋白检测仪中测定待检RNA的浓度、纯度（A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之间）。取总RNA按照RT-reagent逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应获得cDNA，反应体系为：Prime Script RTM aster Mix 2μL。以SYBR Green为荧光标记物，β-actin为内参对照。取cDNA加入聚合酶链反应体系进行扩增，反应体系为：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10μL，Primer F 0.3μL，Primer R 0.3μL，cDNA 1μL，ddH2O 8.4μL扩增条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；62℃ 30 s；共40个循环。扩增反应结束后观察到锐利单一的基因熔解曲线，提示扩增序列有明显特异性，所做实验定量准确。引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.5 统计学方法 PCR扩增反应完成后，结果采用相对定量法2-∆∆Ct。通过融解曲线可得知，无外源性的污染和引物二聚体的存在，扩增是特异性的。统计学方法采用SPSS 18.0软件包，计量资料用（±s）表示，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺对IDPN模型大鼠脑内COMT、MAO-B mRNA的影响 与空白组比较，模型组脑中COMT、MAO-B的mRNA表达量明显降低（P ＜0.05）；与模型组比较，针刺治疗组脑中COMT、MAO-B的mRNA表达量明显升高（P ＜0.05）；与对照组比较，针刺治疗组脑中COMT、MAO-B的mRNA表达量明显升高（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠COMT、MAO-B 的mRNA 表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠COMT、MAO-B 的mRNA 表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与TD 模型组比较，2）P＜0.05；与对照组比较，3）P＜0.05。

2.2 针刺对IDPN 模型大鼠脑内DRD1、DRD2 mRNA的影响 与空白组比较，模型组脑中DRD1 mRNA表达量明显升高，而DRD2 mRNA明显降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，针刺治疗组脑中DRD1 的mRNA表达量降低（P ＜0.05），但不低于对照组（P ＞0.05）；与模型组比较，针刺治疗组脑中DRD2 的mRNA表达量升高（P ＜0.05），但未高于对照组（P ＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠DRD1、DRD2 的mRNA 表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠DRD1、DRD2 的mRNA 表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

3 讨论

本实验除空白组外的30 只大鼠刻板行为和运动行为评分均＞2 分，提示造模成功，且针刺治疗后大鼠抽动行为明显改善，其脑内DA、NE 表达减少，治疗有效，且疗效优于对照组[9]。本实验模型组动物脑内COMT、MAO-B、DRD2 的mRNA表达量明显低于空白组（P ＜0.05），而DRD1 的mRNA表达量明显高于空白组（P ＜0.05），提示I DPN模型大鼠胺类神经递质降解酶和多巴胺受体表达趋势与前人的研究结论相符[10，11]。治疗4 周后，针刺治疗组大鼠脑内COMT、MAO-B的mRNA表达量较模型组和对照组均明显上升（P ＜0.05），提示针刺治疗使大鼠脑内胺类递质降解酶含量明显升高，且高于对照组。针刺治疗组大鼠脑内DRD2 mRNA表达量较模型组明显上升（P ＜0.05），DRD1 mRNA较模型组明显降低（P ＜0.05），但均未优于对照组（P ＞0.05），提示针刺治疗对大鼠脑内DRD1、DRD2 的表达有影响，但未优于氟哌啶醇片的作用。综上所述，本实验显示针刺治疗对I DPN模型大鼠脑内儿茶酚胺降解酶的表达有明显影响，这可能是针刺治疗抽动障碍的分子生物学机制之一。而针刺治疗对多巴胺受体的表达有影响，但干预作用不如氟哌啶醇片。

4 结语

近年来，针刺治疗抽动障碍以临床研究多见，均取得较好效果，百会、合谷、内关、大椎等穴位使用频率较高[12]。然而，针刺治疗抽动障碍的实验研究还较少，尤其在分子生物学水平。本实验从儿茶酚胺类神经递质的代谢途径和多巴胺受体表达入手，选取近期研究较热门的COMT、MAO-B、DRD1、DRD2 为检测指标，探讨针刺治疗抽动障碍的分子生物学机制。

本实验对I DPN大鼠模型治疗4 周后，取大鼠脑组织提取RNA，经过反转录、PCR 等处理后获得COMT、MAO-B、DRD1、DRD2 mRNA，可直接反映儿茶酚氧位甲基转换酶、单胺氧化酶B、多巴胺受体D1、多巴胺受体D2 在脑内的表达量。实验结果显示，针刺组大鼠脑内COMT、MAO-B mRNA表达量较模型组明显升高，且高于对照组，提示大鼠经过针刺治疗后脑内儿茶酚胺类物质分解代谢活跃，从而使胺类神经递质DA、NE等含量降低。这可能是针刺治疗使抽动障碍大鼠模型抽动行为减少的分子机制之一。而DRD1 mRNA表达量较模型组降低，未低于对照组，同时DRD2 mRNA表达量较模型组升高，未高于对照组，提示针刺治疗可通过影响多巴胺受体D1、D2 的表达量对I DPN模型大鼠达到治疗作用，但影响有限，并未优于氟哌啶醇片。综上所述，针刺治疗抽动障碍的效果确切，其作用机制可能是增加了COMT、MAO-B等胺类代谢酶在脑内的表达，从而增加胺类递质的降解，使抽动行为减少，同时对多巴胺受体的表达有轻微影响。然而，针刺是一种物理刺激，或许不是使上述物质表达变化的直接原因。故，针刺刺激通过何种机制使这些酶和受体表达量改变仍值得进一步研究，如电活动方面。