李雪文峰 刘金星 刘鹏飞

（1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院妇科，山东 济南 250014；3.山东中医药大学附属医院生殖中心，山东 济南 250014）

卵巢早衰（Premature ovarian Failure，POF）是以闭经、雌激素水平降低及不同程度的围绝经期症状为临床表现的疾病，是育龄期女性不孕的主要原因之一，因为雌激素水平的下降，罹患心血管疾病、骨质疏松、早期退行性神经系统疾病的风险也随之增加。目前西医多采用激素替代疗法，虽然可以改善患者的临床症状，但停药后易复发，长期服用可增加患子宫内膜癌、乳腺癌等疾病的风险。中医药治疗POF效果显著，本研究通过网络药理学方法探讨四二五合方治疗POF的作用机制，以期为临床治疗本病提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 四二五合方相关靶点筛选 通过TCMSP数据库，获取四二五合方各中药的活性成分，按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18的2个ADME属性值筛选获得活性成分及作用的靶点，利用Uniprot蛋白质数据库将靶点进行标准化。

1.2 卵巢早衰相关靶点筛选 以“Premature Ovarian Failure”为关键词对OMIM数据库、DRUGBANK数据库、Genecards数据库进行检索，获取POF的靶点。

1.3 四二五合方-卵巢早衰靶点功能与通路的富集分析 利用Metascape平台对交集靶点进行富集分析，得到四二五合方治疗POF潜在的生物过程及相关通路。利用Cytoscape 3.8.2构建四二五合方药物成分-卵巢早衰靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 四二五合方活性成分靶点的获取 通过TCMSP数据库，筛选四二五合方各中药活性成分，合并后删除重复值，共获得104个活性成分。

2.2 卵巢早衰相关靶点的获取 从Genecards数据库获得POF靶点4564个。在Genecards数据库中，Score值越高代表该靶点与疾病联系越紧密，根据经验，如果靶点过多，则设置Score大于等于中位数的靶点作为POF的潜在靶点，第一次取Score中位数为3.62，第二次取Score中位数为7.945，设置Score≥7.945的靶点为POF潜在靶点。结合OMIM、DRUGBANK数据库，合并后删除重复值，最终得到1822个POF相关靶点。

2.3 靶点功能与通路的富集分析 运用Venn对四二五合方成分靶点与POF靶点取交集，得到共同靶点139个。将139个共同靶点导入Metascape数据库进行富集分析。结果显示，四二五合方治疗POF的通路有癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白多糖通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、麻疹通路、细胞凋亡通路、缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、雌激素信号通路、疟疾通路、NF-κB信号通路等。见图1。四二五合方参与的生物学过程（Biological processes，BP）主要包括对无机物的应答、受伤的应答、凋亡信号通路、对脂多糖的应答等；细胞成分（Cellular constituent，CC）分析相关靶点治疗卵巢早衰的功能主要富集于膜筏、含胶原的细胞外基质、囊泡腔、蛋白激酶复合物、细胞质核周区、转录调节复合体等；分子功能（Molecular function，MF）分析富集基因数量较大的有蛋白域特异性结合、转录因子结合、蛋白激酶结合、蛋白质同二聚化活性、蛋白激酶活性等。见图2。

图1 四二五合方治疗POF靶点KEGG通路富集分析

图2 四二五合方治疗POF靶点BP、CC、MF富集分析

2.4 四二五合方成分-卵巢早衰靶点-通路网络图的构建 运用Cytoscape 3.8.2构建四二五合方成分-卵巢早衰靶点-通路网络。圆形节点为药物的活性成分，三角形为不同药物间共有的活性成分，菱形为靶点，正方形为不同的中药，倒三角形为通路。节点的面积代表其Degree值，面积越大说明该节点越重要。见图3。Cytoscape网络分析表明，槲皮素为四二五合方治疗POF的主要成分，其次为木犀草素、山柰酚。见表1。

图3 四二五合方成分-卵巢早衰靶点-通路网络图

表1 四二五合方治疗POF主要活性成分网络节点特征参数

预测PTGS2为四二五合方治疗POF的最主要靶点。NCOA2、PGR、HSP90AA1、PTGS1、AR亦为相对重要的靶点。见表2。

表2 四二五合方治疗POF主要靶点网络节点特征参数

3 讨论

POF目前在临床上患病率越来越高，中药治疗POF的效果不劣于甚至优于临床一线西药，尤其在改善卵巢功能方面潜力极大。张慧珍等[1]通过随机对照研究证实，四二五合方合甘麦大枣汤比激素替代疗法更能改善围绝经期患者的卵巢功能及抑郁症症状。李兰等[2]通过分析CNKI从建库至2020年2月收录的文献发现，POF的病因以肾虚为主，补肾益精法应贯穿疾病治疗始终。四二五合方中五子衍宗丸补肾填精；四物汤养血和血，精血同源，补血以生精；淫羊藿性温不燥，补肾壮阳，于阳中求阴；知母泻相火坚肾阴，亦可制约淫羊藿的温热之性，并回归补肾益阴之本意。全方共奏补肾填精之功效。

本研究通过网络药理学方法初步筛选出四二五合方治疗POF的活性成分为槲皮素、木犀草素等。槲皮素可以通过增强卵巢组织的抗氧化能力，抑制卵巢的过度氧化应激，减少细胞凋亡。木犀草素可以通过降低凋亡相关蛋白的表达，抑制POF小鼠卵巢的氧化损伤及细胞凋亡。四二五合方治疗POF的靶点主要集中在PTGS2。PTGS2是前列腺素E2（PGE2）合成的末端限速酶，PGE2是一种介导黄体生成素峰的旁分泌信号因子，可促进卵丘扩张、卵母细胞成熟及卵泡破裂等生物过程，PTGS2可促进PGE2的合成，促进排卵过程的发生[3]。

四二五合方治疗POF与IL-17信号通路、细胞凋亡、HIF-1信号通路密切相关。Th17可以通过释放炎症因子IL-17促进免疫，Treg细胞可以抑制免疫，在自身免疫性POF中存在Th17/Treg细胞比失衡及血清IL-17水平上升。改善Th17/Treg细胞比失衡及降低血清IL-17水平可以改善卵巢功能。化疗药物、氧化应激、放疗可以通过上调凋亡分子表达、下调抗凋亡分子的表达，诱导颗粒细胞的凋亡，放疗还可以通过诱导垂体腺细胞凋亡，下调FSH和LH表达，减弱对卵泡发育的刺激，引起POF。氧化损伤可使卵泡质量下降，最终导致卵巢储备功能减退。HIF-1可以参与许多低氧反应相关基因的表达，增强细胞对缺氧的适应能力，减少因缺氧导致的细胞凋亡。HIF-1可激活促红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子VEGF，激发调节血管生成、红细胞生成的作用，并能参与FSH诱导的卵泡血管的生成，为卵泡的发育提供氧气、营养及促性腺激素[4]。持续的炎症会使耗氧量增加，导致炎症组织内局部缺氧，缺氧的炎症环境会使细胞内HIF-1的水平增加，累积的HIF-1可促进Th17细胞分化、抑制Treg细胞分化、减少中性粒细胞的凋亡，增加炎症的持久性，由此推测HIF-1对自身免疫性POF的发生发展有一定促进作用[5]。综上，四二五合方可能通过细胞凋亡、氧化应激途径来治疗POF。

本研究通过网络药理学分析及文献查阅，发现四二五合方可以多成分、多靶点、多通路联合作用于POF，但由于中药成分在煎煮时发生化学反应的复杂性，本研究未将四二五合方煎煮后的化学成分以及四二五合方活性成分在体内的代谢物纳入分析。但可以确定四二五合方可通过多成分、多靶点、多通路治疗POF，其具体机制还需要开展相关实验研究验证。