＊范红革 岳彩欣 张鸿雁 孙雪 冯德日

（沈阳医学院 辽宁 110034）

活性氧自由基（ROS）是体内线粒体呼吸链传递电子过程中产生的副产物，ROS在体内的大量堆积会引起体内组织细胞脂质过氧化现象，从而导致细胞的损伤和衰老。体内存在着多种可以清除ROS的抗氧化物酶，其中谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）清除ROS的作用非常重要[1,2]。研究表明，体内GPX活性的降低及减少与临床上多项疾病的发生、发展密切相关，包括克山病、各种心脑血管疾病及癌症等[3]。但在实际的临床应用中，天然的GPX具有来源有限、在体内稳定性差、不易被吸收等特点，这限制了其在临床上的医疗应用价值。因此，近年来越来越多的科研人员致力于GPX模拟物的人工合成研究，如Ebselen（PZ51），硒（碲）化环糊精，硒（碲）化GPX单克隆抗体酶等，其中Ebselen是研发最早的一种GPX模拟物，被称为“小分子硒酶”，现已进入实际的临床应用中[4,5]。

4-叔丁基杯[4]芳烃是继环糊精和冠醚之后广受瞩目的第三代有机合成超分子，其是由4个苯酚单元通过亚甲基在酚羟基邻位连接而成的环状小分子聚合物[6,7]。在其分子结构中，每个苯酚单元下端都含有1个活性羟基基团，可以作为修饰活化的目标靶点，进行多种酶催化基团的修饰改造。同时，4个苯酚单元在空间上连接成环状，在其分子内部形成一个类似于酶活性中心的疏水腔结构，非常有利于其与各种酶催化底物的结合。近年来，科研人员通过以4-叔丁基杯[4]芳烃为修饰底物，将其改造为多种酶的人工模物[8]。

在本研究中，我们以4-叔丁基杯[4]芳烃为GPX模拟物的修饰底物，将GPX酶的关键催化基团-金属碲（Te）特异的修饰到其疏水腔结构下缘苯酚单元的-OH基团上，合成了一种新化合物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烃，该模拟物具有显著的GPX活性，合成方法如图1所示。为了进一步研究该模拟物的体外抗氧化效果，我们还建立了由H2O2诱导的血红细胞体外氧化损伤体系，对该模拟物的抗氧化活性进行研究[9]。

图1 碲代4-叔丁基杯[4]芳烃合成路线

1.实验方法

(1)试剂与仪器

对甲苯磺酰氯（p-TsCl）、4-叔丁基杯[4]芳烃、寒羊血购自上海国药集团有限公司；碲（Te）、谷胱甘肽（GSH）、辅酶（NADPH）、H2O2购于德国Sigma公司；其它试剂为国产分析。

Agilent 7890A-5975C型质谱仪（美国Agilent公司）；Bruker-300型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）TMS为内标，甲醇为溶剂；UV-120分光光度计（日本岛津公司）；日本日立荧光分光光度计（日本岛津公司）。

(2)模拟物的制备方法

①合成化合物2

将50mL二氯甲烷加入三口烧瓶中，然后分别加入3.0g 4-叔丁基杯[4]芳烃和1.8mL三乙胺。将反应液放入0℃冰盐浴中，30min内滴加P-TsCl/乙腈溶液（3.8g/10mL）。然后将反应液放入室温条件下，搅拌反应12h。反应结束后，将大部分溶剂从反应液中蒸出，再分别加入1M稀盐酸和50mL氯仿，继续室温搅拌15min。反应液有机相用NaHCO3萃取三次，调有机相pH值至中性，经无水硫酸镁干燥、过滤。有机相旋转蒸发出大部分氯仿，再加入甲醇，有白色沉淀析出，沉淀经抽滤、甲醇重结晶，最终得到3.45g白色固体，产率为81%，mp176.0～177.4℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.75(bs，2H，OH)，7.08(s，4H，ArH)，6.79(bs，8H，ArH)，6.53(s，4H，ArH)，4.26(d，4H，ArCH2Ar)，3.12(d，4H，ArCH2Ar)，1.43(s，6H，ArCH3)，1.29［s，18H，C(CH3)3］，0.97［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:956.32[M+HI]+。

②NaHTe的制备

NaHTe的制备方法，参考文献[5]。

③合成化合物3

将DMF/H2O（体积比为1:1）加入到三口烧瓶中，在氮气保护下分别加入100mg化合物2和4mL NaHTe，60℃搅拌反应24h。二氯甲烷萃取反应液3次，合并有机相，有机相经无水硫酸镁干燥、过滤，有机相减压蒸干，得黄色油状物67mg。产物进一步经硅胶柱层析分离、纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯（V:V=5:1），最终得淡黄色固体52mg，产率63%，mp157.2～158.5℃；1HNMR(CDCl3，400MHz)δ:7.73(bs，2H，OH)，7.18(s，4H，ArH)，6.58(s，4H，ArH)，4.06(d，4H，ArCH2Ar)，3.33(d，4H，ArCH2Ar)，1.18［s，18H，C(CH3)3］，0.86［s，18H，C(CH3)3］；ESI-MS，m/z:870.31[M+HI]+。

(3)模拟物GPX活力测定

我们对模拟物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烃的GPX活性进行测定，具体测定方法见文献[2]。

(4)模拟物体外抗血红细胞氧化损伤活性测定

①由H2O2诱导的体外血红细胞氧化损伤评价体系的建立

系统Ⅰ：1ml红细胞悬液；

系统Ⅱ：1ml红细胞悬液加入终浓度为10mM的H2O2；

系统Ⅲ：系统Ⅱ中加入终浓度为0.02μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烃和0.05mM的GSH；

系统Ⅳ：系统Ⅱ中加入终浓度为0.05μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烃和0.05mM的GSH；

系统Ⅴ：系统Ⅱ中加入终浓度为0.1μM的碲代4-叔丁基杯[4]芳烃和0.05mM的GSH。

其中系统Ⅰ为空白组；系统Ⅱ为损伤组；系统Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别为加入不同浓度碲代4-叔丁基杯[4]芳烃的保护组。

②损伤血红细胞溶血度的测定

系统Ⅰ～Ⅴ于37℃温浴1h，1500rpm离心5min后，取上清液，测各系统溶液540nm下的光吸收值OD540，测定血红蛋白的含量。

③丙二醛生成量的测定

系统Ⅰ～Ⅴ于37℃温浴1h，1500rpm离心后取上清液1.0ml，加入0.5ml硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴30min，冷却后1500rpm离心5min，测各系统溶液532nm下的光吸收值OD532，测定丙二醛的生成量。

④脂褐质生成量的测定

系统Ⅰ～Ⅴ于37℃温浴1h，加入五倍低渗PBS中，4℃下放置30min，使之完全溶血，16000rpm离心30min后去上清，洗涤沉淀三次。得到乳白色的影膜（发暗）。用1:2的甲醇-氯仿溶液抽提血影膜，有机相用荧光分光光度计于300～400nm范围内扫描最大激发波长，然后以其最大激发波长在400～500nm范围内进行荧光强度的测定。

2.结果和讨论

(1)模拟物的GPX活性

实验结果表明，碲代4-叔丁基杯[4]芳烃的天然GPX活力达到了321.16U/μmol。同时，我们还将该模拟物的GPX活性与其他几种以报道的GPX模拟物活性[10]进行了比较，结果如表1所示。

表1 不同GPX模拟物的酶活性比较

(2)模拟物抗血红细胞氧化损伤的保护作用

①模拟物可以降低血红细胞的溶血度

以H2O2诱导的血红细胞损伤组溶血度为100%，其它各保护组及空白组的溶血度为保护组及空白组的OD540与前者OD540的百分比。从表2可以看出，不同浓度的碲代4-叔丁基杯[4]芳烃对于由H2O2诱导的血红细胞溶血现象都有一定的保护作用，且其保护作用随着模拟物浓度的升高而越来越显著。其中0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烃保护组的红细胞溶血保护度已经接近空白组红细胞发生自溶血现象的溶血保护度。

表2 碲代4-叔丁基杯[4]芳烃对由H2O2诱导的血红细胞溶血保护作用

②模拟物可以抑制损伤血红细胞中丙二醛的生成

H2O2诱导血红细胞氧化损伤后，血红细胞内大量的脂肪酸等物质会发生显著的脂质过氧化现象，该过氧化反应的终产物是丙二醛（MDA），MDA在细胞中的生成量可以表明血红细胞的脂质过氧化程度。图2的实验结果表明，在由H2O2诱导血红细胞损伤组中，其MDA的生成量会显著增加，说明红细胞内脂质过氧化现象严重。而在加入模拟物碲代4-叔丁基杯[4]芳烃后的保护组中，MDA的生成量都有一定程度的降低，且随着模拟物浓度的提高，则保护组中MDA生成量会越来越少。0.1μM碲代4-叔丁基杯[4]芳烃保护组中MDA生成量仅为损伤组的36.2%。结果表明碲代4-叔丁基杯[4]芳烃可以有效的抑制损伤血红细胞中脂质过氧化现象的发生。

图2 不同浓度碲代4-叔丁基杯[4]芳烃对MDA生成抑制作用的比较

③模拟物可以抑制损伤血红细胞中脂褐质的生成

损伤血红细胞中脂质过氧化反应终产物丙二醛MDA可以进一步与游离氨基生成荧光性的Schiff碱分子-脂褐质，其在300～400nm光激发条件下，在400～500nm可以产生荧光。因而我们通过测定损伤血红细胞过氧化反应产物中脂褐质的荧光强度来进一步评价碲代4-叔丁基杯[4]芳烃体外抗氧化活性。图3表示以393nm为激发波长，在454nm条件下测定的各组荧光强度评价结果。该实验结果基本上与损伤血红细胞中MDA生成量评价结果相吻合，加入模拟物碲代4-叔丁基杯[4]芳烃后的保护组可以明显的抑制血红细胞中脂质过氧化现象的发生，且抑制效果随模拟物浓度的增加而逐渐加强。

图3 不同浓度碲代4-叔丁基杯[4]芳烃对脂褐质生成抑制作用的比较

3.总结

我们将GPX酶关键催化基团-金属碲（-Te）引入到底物4-叔丁基杯[4]芳烃结构中苯酚单元的-OH基团上，合成了一种新的GPX模拟物-碲代4-叔丁基杯[4]芳烃。其天然GPX活性可达321.16U/μmol，虽然该模拟物的GPX活性与天然GPX酶的活性相比仍存在一定差距，但相比于几种已报道的GPX模拟物来说，该模拟物已经表现出了更显著的抗氧化活性。同时，我们建立了由H2O2诱导的体外血红细胞氧化损伤体系，对该模拟物的体外抗氧化活性进行了进一步的研究。实验结果表明，模拟物碲代4-叔丁基杯[4]芳烃对于由H2O2诱导的血红细胞氧化损伤现象具有明显的抑制作用。其能够有效的降低血红细胞溶血现象，同时还可以明显抑制损伤血红细胞中脂质过氧化产物MDA及脂褐质的累积。