岳 丽，孙佳瑶，刘龙芳

脑小血管病(cerebral small vessel disease， CSVD)是临床常见脑血管疾病类型，不仅是导致缺血性脑卒中发生的主要原因之一，还会引起认知功能障碍，尤其是老年患者。据统计，CSVD所致的认知功能障碍占所有血管性痴呆的36%～67%[1-2]。CSVD继发认知损伤的致病机制不明确，可能与基础疾病、年龄、相关外周血标志物水平等因素有关[3]。G蛋白耦联雌激素受体30(GPR30)是雌激素非典型的膜性受体，近年来有研究证实其具有神经保护、抗神经炎症、促进神经元修复等作用[4-5]。因此推测其可能参与CSVD所致认知功能障碍发生发展过程。本研究探讨外周血GPR30表达水平在CSVD致认知功能障碍中的变化情况，为临床评估其发生风险、病情程度、预测预后提供可靠的依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择我院2018年7月—2020年12月收治的CSVD致认知功能障碍92例作为观察组，CSVD后无认知功能障碍92例作为对照组。纳入标准：均经头颅CT、MRI检查可见CSVD病灶，符合CSVD相关诊断标准[6]；CSVD发生前认知功能正常；观察组CSVD发生后6个月内出现智力减退、反应迟钝、记忆或其他认知功能进行性损害症状，简易智能精神状态检查量表(MMSE)评分<27分，符合血管性认知功能障碍诊断标准[7]；对照组CSVD发生后6个月内无认知功能障碍，MMSE评分≥27分；2组临床资料完整。排除标准：合并多发性硬化、神经系统退行性疾病、精神疾病、血液系统疾病等其他重大疾病者；伴有颅内大血管病变者；无法配合检查者；合并恶性肿瘤者；存在颅脑外伤、脑血管畸形者；由于其他原因所致认知功能障碍者。观察组男50例，女42例；年龄48～79(58.43±3.46)岁；体质量指数(BMI)17～28(22.30±1.81)kg/m2；美国国立卫生院神经功能缺损量表(NIHSS)评分8～14(10.38±1.34)分；CSVD发病部位：基底节区33例，丘脑21例，皮层或皮层下25例，额叶13例。对照组男53例，女39例；年龄45～72(54.06±3.03)岁；BMI 17～29(22.62±1.72)kg/m2；NIHSS评分6～12(9.20±1.06)分；CSVD发病部位：基底节区30例，丘脑23例，皮层或皮层下24例，额叶15例。2组性别、BMI、CSVD发病部位比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组年龄、NIHSS评分比较差异有统计学意义(P<0.05)。

1.2方法 2组均于CSVD发生后6个月复查认知功能时检测外周血单个核细胞(PBMC)中GPR30蛋白与mRNA表达情况。采集清晨空腹静脉血4 ml，抗凝，提取PBMC，置入-80 ℃恒温冰箱内，备用。①PBMC中GPR30 mRNA相对表达量检测方法：采用购自全式金生物公司的Tranzol up试剂盒提取细胞RNA，逆转录(美国Invitrogen公司的试剂盒)合成cDNA。由上海康成生物有限公司设计合成引物序列，GPR30：F：5'-AACCCAACCCAAACCACCACA-3'，R：5'-AAGATTTGCCGAAAGGCTCCC-3'；β-actin：F：5'-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'，R：5'-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3'。行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)，反应条件：预变性95 ℃ 600 s，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 60 s，延伸60 ℃ 60 s，共进行40个循环。抽取PCR扩增产物(10 μl)，在琼脂糖凝胶(1.5%)条件下电泳，采用图像分析系统扫描电泳图像，以β-actin为内参，计算GPR30 mRNA相对表达量。②PBMC中GPR30蛋白相对灰度值检测方法：将提取的PBMC取出置于冰上，制备蛋白样品，采用美国贝克曼库尔特公司BCATM试剂盒测定蛋白浓度，依次采取电泳准备、转膜、封闭及孵抗、显影等步骤。图片扫描保存，采用Image J软件将图片上特异条带灰度值数字化。

1.3认知功能障碍程度和预后判定标准

1.3.1认知功能障碍程度判定标准[8]：以MMSE评分为依据，21～26分为轻度，10～20分为中度，0～9分为重度。

1.3.2预后判定标准[9]：观察组证实为CSVD致认知功能障碍后给予常规认知功能训练、保护脑细胞、营养脑神经等对症治疗。治疗3个月后评估疗效，疗效指数=(治疗后MMSE评分-治疗前MMSE评分)/治疗前MMSE评分×100%。疗效指数>50%为显效，20%～50%为进步，≤20%为无效，将显效、进步纳入预后良好组，无效纳入预后不良组。

2 结果

2.1PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况 观察组PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量低于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 2组CSVD PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况比较

2.2观察组不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况 观察组不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.01)；重度患者PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量低于中度、轻度患者，中度患者低于轻度患者(P<0.05)。见表2。

表2 观察组不同病情程度患者PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况比较

2.3观察组PBMC中GPR30蛋白、mRNA表达情况与认知功能障碍发生风险、病情程度的关系 Spearman相关性分析显示，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量与认知功能障碍发生风险、病情程度呈负相关(P<0.01)。见表3。

2.4观察组不同预后患者临床资料、PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况 观察组不同预后患者性别、BMI、发病部位比较差异无统计学意义(P>0.05)；预后不良组年龄、NIHSS评分、认知功能障碍程度高于预后良好组，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量低于预后良好组(P<0.01)。见表4。

2.5PBMC中GPR30蛋白、mRNA对CSVD致认知功能障碍预后的影响 多因素Logistic回归分析显示，在校正其他因素前后，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量均与预后独立相关(P<0.01)。见表5。

2.6PBMC中GPR30蛋白、mRNA对CSVD致认知功能障碍预后的预测价值 ROC曲线分析，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值及GPR30 mRNA相对表达量预测CSVD致认知功能障碍预后的曲线下面积(AUC)均>0.7,且GPR30蛋白相对灰度值预测CSVD致认知功能障碍预后的AUC大于GPR30 mRNA相对表达量，见表6和图1。

图1 PBMC中GPR30蛋白、mRNA对CSVD致认知功能障碍预后的预测价值ROC曲线CSVD为脑小血管病，PBMC为外周血单个核细胞，GPR30为G蛋白耦联雌激素受体30，ROC为受试者工作特征

表3 观察组PBMC中GPR30蛋白、mRNA表达情况与认知功能障碍发生风险、病情程度的关系

表4 观察组不同预后患者临床资料、PBMC中GPR30蛋白与mRNA表达情况

表5 PBMC中GPR30蛋白、mRNA对CSVD致认知功能障碍预后的影响

表6 PBMC中GPR30蛋白、mRNA对CSVD致认知功能障碍预后的预测价值

3 讨论

近年来，随着老龄化加剧，CSVD发病率呈逐渐升高趋势，导致继发认知功能障碍可能性显著增加，对患者日常生活活动能力、生活质量产生严重影响[10]。目前，临床虽然未完全明确CSVD致认知功能障碍的机制，但发现此过程是由认知正常到痴呆的连续性过程，若在早期确诊、及时干预，则会明显缓解临床症状，防止病情进展至痴呆，反之一旦病情进展至中后期，不仅临床症状难以缓解，同时也无法避免痴呆的发生[11-12]。因此，寻找可靠的标志物进行早期诊断对防治CSVD致认知功能障碍至关重要。

GPR30是一种广泛分布在全身各个器官组织中的新型7次跨膜雌激素膜受体，与雌激素受体ERα、ERβ无同源性，在雌激素非基因组效应中发挥主要作用，参与炎症反应、免疫反应、肥胖、妇科恶性肿瘤等多种雌激素依赖性疾病发生发展过程[13-14]。随着临床研究的不断深入，有学者证实GPR30除了在雌激素依赖性疾病中扮演重要角色之外，还在脑血管疾病中具有保护神经功能作用[15]。相关动物实验指出，GPR30活化后可能经由抑制TLR4/NF-κB通路减少蛛网膜下腔出血后神经元凋亡，促进早期脑损伤修复，保护神经功能[16]。本研究发现,PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量在CSVD致认知功能障碍患者中显著下调，且随病情加重呈逐渐下调趋势。与李建立等[17]报道一致。结合国内外研究分析原因：GPR30作为雌激素膜受体能通过介导17β雌二醇激活下游信号通路，于短时间内发挥神经保护作用[18]；GPR30激活能快速上调AKT、ERK促生存信号通路，抑制神经细胞凋亡，减轻神经炎症损伤，保护海马体与神经元，从而促进认知功能改善[19]；星形胶质细胞GPR30可经由p38MAPK信号通路参与动脉粥样硬化调控，起到神经保护作用[20]。另外，有研究表明，中枢胆碱能系统在维持人正常学习记忆功能方面具有至关重要的作用，乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)是该作用机制中的关键递质，而抑制GPR30表达会促使海马组织ACh含量减少，AChE含量增加，促进认知功能损害发生发展；相反GPR30活化后能介导17β雌二醇刺激ACh释放，抑制AChE活性，改善认知功能[21]。由此可知，GPR30表达下调会促进CSVD后认知功能障碍发生。本研究还发现，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量与认知功能障碍发生风险、病情程度呈负相关，提示临床可通过给予GPR30激动剂防治或延缓CSVD后认知功能障碍发生，控制病情进展。

同时，在CSVD致认知功能障碍患者中，预后不良患者PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量低于预后良好患者，且在校正其他因素前后，二者均与预后独立相关，表明临床可将外周血GPR30作为预测CSVD致认知功能障碍患者预后的预测指标。进一步采用ROC曲线分析，PBMC中GPR30蛋白相对灰度值、mRNA相对表达量预测CSVD致认知功能障碍预后的AUC均>0.7，可见二者在预后预测中均有良好的应用价值，有助于临床采取针对性干预措施改善预后，降低预后不良风险。

综上所述，外周血GPR30水平在CSVD致认知功能障碍患者中呈显著下调趋势，与认知功能障碍发生风险、病情程度显著相关，还可作为预测预后的重要辅助指标。不足之处：未对GPR30激动剂在CSVD致认知功能障碍中的应用效果进行详细探讨，今后需实施深入研究与分析。