刘一儒， 于雪冬， 齐慧敏， 梁运江， 李太元， 许广波

(延边大学 农学院，吉林 延吉 133002)

猪苓(PolyporusumbellatusPers.Fr.)是我国常见的中药材之一[1]，它的药用历史可追溯到2000年以前，别名有猪茯苓、野猪粪、猪灵芝等[2-4]。长白山猪苓又名鸡爪苓，是长白山特有的种质资源。猪苓主要由长在地下土层中的菌核以及长在地面上的子实体组成。它的干燥菌核常用来入药，在中医临床应用上，因其具有渗水利湿的效果，所以常用于治疗全身浮肿、尿急尿频、急性肝炎、急性肾炎等疾病[5-6]。

多糖是猪苓的主要活性成分，具有较好的调节免疫作用、抗肿瘤、延缓衰老、增强免疫和保护肝脏等作用[7-9]。甾体类化合物是猪苓的主要化学成分，具有利水渗湿功效[10]，其中，麦角甾醇已被《中国药典》收入作为猪苓指标性成分[11]。

中药指纹图谱是一种可量化的质量分析方法，它是用某些发现方法分析处理后的中药材或中成药得到共有峰图谱，这些共有峰图谱能够宏观、全面的展示各种中药、中成药及其制剂的各种化学成分及含量，进而反映药材的质量[12-14]。对于中药材来说，由于其复杂的化学组成成分，即使同种药材在不同环境、地理位置、不同采摘时间及不同存储方式下都会产生化学成分含量差异，它们的指纹图谱也会存在较大的差异。因此，需要化学模式识别方法来处理分析数据，再提取其中的化学特征信息来解决它的复杂性[15]。

该研究以长白山区不同产地25个猪苓为试验材料，测定它们主要药效成分麦角甾醇和多糖含量；通过高效液相色谱法(HPLC)建立长白山区猪苓的指纹图谱，并结合化学模式识别分析方法分析猪苓质量差异，利用主成分进一步探索不同产地猪苓综合质量，初步评价长白山区不同产地的猪苓质量，为解决猪苓的质量控制问题提供参考，以便合理开发利用长白山猪苓资源。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

岛津LC-2010A高效液相色谱仪、麦角甾醇标准品(纯度≥98%，北京盛世康普化工技术研究院)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱级)。

1.2 猪苓菌核材料

该试验采集了不同产地的25个猪苓(鸡爪苓)菌核，这些猪苓菌核采自长白山区具有代表性的猪苓产地，猪苓产地的基本状况见表1。

1.3 麦角甾醇对照品溶液的制备

精密称取麦角甾醇对照品0.006 g放入烧杯中，倒入甲醇使其溶解，将溶解后的溶液定容于100 mL的容量瓶中得到0.06 mg/mL的对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，放入4 ℃冷藏箱中保存备用。

1.4 猪苓菌核样品溶液的制备

精密称取猪苓菌核样品粉末0.5 g放入三角瓶中，并加入精密量取的甲醇10 mL，称定其重量后记录并盖塞，经过超声处理后放冷，加纯甲醇补足至记录的重量，再用0.45 μm的滤膜将样品溶液过滤，得到猪苓菌核样品溶液。

表1 长白山区不同猪苓产地的基本状况

1.5 猪苓指纹图谱试验条件的选择

该试验选用254 nm作为检测波长，在该波长下呈现大多数色谱峰，通过查阅猪苓相关文献，发现刘国库[16]、鲁文静等[17]人都选取254 nm作为检测波长；分别用流动相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.3%乙酸水的梯度洗脱方式比较分离情况，其中，乙腈-水能够相对较好的洗脱猪苓菌核成分但是响应值较低，用乙腈-0.3%乙酸水做流动相会提高响应值，洗脱时间程序如图1；对柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)进行考察，发现柱温为30 ℃和流速为1.0 mL/min色谱图的分离效果最好。

图1 流动相洗脱梯度

分别用纯甲醇、70%甲醇、50%甲醇对猪苓菌核进行时间为40、60、80 min的提取，结果表明，纯甲醇提取的指纹图谱的峰面积较高，提取时间为60和80 min时指纹图谱的峰面积较高且相差不大，因此，选择用纯甲醇超声提取60 min。

最终确定实验条件：色谱条件为色谱柱为ZORBAX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.3%乙酸水，检测波长为254 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL；提取条件为纯甲醇超声提取60 min。

1.6 猪苓指纹图谱方法学考察

1.6.1 精密度试验

取同一样品猪苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取条件下制备猪苓菌核样品溶液，精密吸取1 mL，在最佳色谱条件连续进样5次，记录样品共有峰的保留时间和峰面积。

1.6.2 重复性试验

取同一样品猪苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取条件下制备猪苓菌核样品溶液，精密量取该溶液5份，在最佳色谱条件下分别进样，记录样品色谱峰保留时间和峰面积。

1.6.3 稳定性试验

取同一样品猪苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取条件下制备猪苓菌核样品溶液，在最佳色谱条件下分别在0，4，6，8，10，12，24 h进样，记录样品色谱峰保留时间和峰面积。

1.6.4 考察结果

由于10号色谱峰含量较高，保留时间很稳定，因此选择10号峰作为参照峰，并以它计算猪苓菌核样品JDH-1相对保留时间以及相对峰面积。通过对精密度考察结果可以发现，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.32%和3.02%，表明仪器精密度良好；由重复性考察结果可以发现，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.25%和5.36%，说明该方法的重复性良好；由稳定性考察结果可以发现，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD小于2.73%，说明猪苓菌核样品溶液在24 h内是稳定的。

1.7 数据处理与分析

将25个猪苓菌核样品的HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，对色谱峰进行多点校正，生成对照指纹图谱图，并进行相似度评价分析。将25个长白山区不同产地猪苓菌核HPLC指纹图谱共有峰面积导入SPSS 22.0分析软件，以10个共有峰峰面积为参数，利用组间联接聚类法和平方欧氏距离进行系统聚类分析。采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法判别制作25个猪苓菌核样品的得分矩阵图。

2 结果与分析

2.1 猪苓指纹图谱的建立

在中国药典中以及相关文献中，可知麦角甾醇是猪苓的特征性成分，故选该成分作为对照品进行分析(图2)。

图2 麦角甾醇对照品色谱图

按照1.5的最佳提取条件和色谱条件，得到25个长白山区不同产地猪苓菌核样品色谱图数据，将这25个猪苓菌核样品图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，采用“平均数”法，经多点校正确定了10个共有峰。其中,10号峰通过比对指认为麦角甾醇，并进行数据匹配，生成对照指纹图谱(图3)，并得到25个长白山区猪苓菌核对应的指纹图谱(图4)，其中,有标为A、B的两个峰有待于深入研究。

图3 猪苓对照指纹图谱

图4 25个长白山区不同产地猪苓指纹图谱

以10号峰作为参照峰，按公式计算25个长白山区不同产地猪苓菌核样品的10个共有峰的相对保留时间及相对峰面积(表2，3)。

相对保留时间=各组分峰的保留时间/参照峰的保留时间；相对保留峰面积=各组分峰的峰面积/参照峰的峰面积。

表2 25个长白山区不同产地猪苓指纹图谱中共有峰的相对保留时间

表3 25个长白山区不同产地猪苓指纹图谱中共有峰的相对峰面积

续表3 25个长白山区不同产地猪苓指纹图谱中共有峰的相对峰面积

由表2,3可知，长白山区不同产地猪苓菌核HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间RSD值小于0.24%，而各共有峰相对峰面积的RSD相差较大，说明猪苓菌核样品的峰面积间有差异，这就代表猪苓菌核样品的化学成分含量相差较大，表明质量有一定差异。

2.2 猪苓指纹图谱的相似度评价

将25个猪苓菌核样品的色谱图数据导入“中国色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”并生成猪苓对照指纹图谱后，按夹角余弦法对这25个猪苓菌核样品与猪苓对照指纹图谱进行比较得到猪苓菌核样品相似度数据，再根据相似度数据绘制热图(图5)。经过相似度评价，所选择的25个长白山区猪苓菌核的指纹图谱相似度为0.819～0.979，由于并不是所有样品相似度都达到0.9，说明样品成分之间有一定差异。

注：越绿表示相似度越高，越红表示相似度越低，黄色表示介于中间。

2.3 猪苓指纹图谱结合化学模式识别分析

2.3.1 猪苓菌核的聚类分析

将25个长白山区不同产地猪苓菌核HPLC指纹图谱共有峰面积导入SPSS 22.0分析软件，以10个共有峰峰面积为参数，利用组间联接聚类法和平方欧氏距离进行系统聚类分析(图6)。组间的距离值(临界值R)越小则样品间的差异越小。当分类距离<5时，除样品HMDJ-1、HMDJ-4、LBX-1、JAT-1外，其他样品就已聚为一类，在5<分类距离<10时，样品HMDJ-4、LBX-1、JAT-1也逐渐与其他样品聚集在一起，当分类距离>20时，样品JAT-1才与其他样品有交点，说明样品JAT-1与其他样品有一定差异。这可能是由于不同产地猪苓环境有差异，也有可能是其他因素导致部分化学成分的含量具有一定的差异。

图6 25个长白山猪苓聚类结果图

2.3.2 猪苓菌核的主成分分析(PCA)

为了能够评价10个共有成分对样品的分辨能力，采用SPSS 22.0版软件对25个长白山区猪苓菌核共有峰数据进行主成分分析，求出相关矩阵的特征值及其贡献率(表4)，并以它们作为依据筛选主成分。以特征值>1为标准的结果显示，3个主成分的累积方差贡献率为75.996%，包含了大部分的信息，达到了降维的目的。其中，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)、第3主成分(PC3)特征根分别为4.629、1.609和1.362，方差贡献率分别为46.287%、16.09%和13.619%。PCA碎石图(图7)，率先提取出来的3个成分的坡度较为陡峭而后续形成的坡度较为平缓，说明这3个主成分可能就是鉴别长白山区猪苓最主要的色谱峰。

通过旋转后共有峰因子载荷矩阵(表5)发现，第1主成分的信息包括色谱峰1～4、6～8；第2主成分的信息包括色谱峰4、9～10；第3主成分的信息包括色谱峰5、10，说明有多个成分作用共同影响猪苓菌核的质量。

为了分析长白山猪苓菌核质量的差异性规律，利用SIMCA 14.1软件对25个长白山区猪苓指纹图谱的数据进行PCA-X分析(图8)。从图8中可以更清楚的看出不同产地样品分布情况，样品分布距离越远表明差异性越大，除了JAT-1的猪苓菌核，其他猪苓菌核依次聚为一类，表明长白山区不同产地的猪苓间存在一定的相关性，结果与聚类分析结果一致。

表4 猪苓的特征值和方差贡献率

图7 猪苓的主成分碎石图

表5 猪苓的旋转后共有峰因子载荷矩阵

图8 猪苓主成分分析PCA-得分图

2.3.3 猪苓菌核的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)

采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法判别分析对25个猪苓菌核样品进一步分析，得分矩阵图见图9。该模型R2X(cum)=0.991，R2Y(cum)=0.894，Q2=0.573，该模型各数值均大于0.5，说明模型稳定可靠，适合作为长白山区猪苓指纹图谱的模式识别方法。通过变量重要性投影值(VIP)来筛选能引起长白山猪苓菌核成分差异的主要标记性成分，其中，拥有较大VIP值的变量，对分类的贡献越大。以VIP>1为标准，从图10可以看出，筛选出对模型上2组间分类贡献较大的4个变量，依次是色谱峰2、色谱峰10、色谱峰5、色谱峰4，其中，色谱峰10被指认为麦角甾醇。

图9 猪苓的OPLS-DA得分图

图10 猪苓的正交偏最小二乘法判别分析VIP值图

3 讨论

该试验建立了长白山区不同产地25个猪苓菌核的HPLC指纹图谱，利用《中国药典》“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004”版确定了10个共有峰，指认了其中1个成分为麦角甾醇。25个猪苓指纹图谱的相似度为0.819～0.979，表明不同产地猪苓之间有一定差异。这与刘国库[16]研究结果相似，但刘国库采集了秦岭、燕山、太行山、长白山、云贵高原和关中平原6个产区的猪苓，其猪苓指纹图谱的相似度为0.486～0.972，差异很大，可能是由于采集的猪苓产区跨度大，尤其长白山产区的猪苓被认为应该单独归为一类。由于无法确定引起差异的具体原因，因此同时结合化学计量学方法对长白山区猪苓进行质量评价，由聚类分析、主成分分析结果可知，当分类距离大于20时，除JAT-1外，其余猪苓菌核已经聚集在一起，可以认为JAT-1的猪苓菌核与其他猪苓菌核有差别，可能是生长环境不同导致。由正交偏最小二乘判别分析发现5个造成不同猪苓菌核质量差异性的主要标记物依次是峰2、峰10、峰5、峰4，其中，峰10是麦角甾醇。

该试验采用HPLC中药指纹图谱技术结合化学模式识别分析的方法，可以更可靠的用于中药质量评价[18]，对于长白山区不同产地猪苓质量评价有初步判断，为更深入地研究猪苓，更有效的控制猪苓质量提供一个参考。

由于猪苓中的内含化学成分多而复杂，并且会受到外界的影响，因此所建立的猪苓指纹图谱具有“模糊性”。该试验的猪苓指纹图谱中除了这10个共有峰外，有2个峰在多个样品中出现且面积较大，已在指纹图谱中标记为峰A和峰B，有待进一步用更多样品进行验证是不是猪苓共有成分，在后续的研究中可以使用仪器联用技术来建立更完整、详细的猪苓指纹图谱。

4 结论

该试验建立了长白山区不同产地的25个猪苓(鸡爪苓)样品的HPLC指纹图谱，25个猪苓指纹图谱的相似度为0.819～0.979，说明不同产地的猪苓菌核样品质量有差异；聚类分析和主成分分析均显示猪苓分为2类；通过正交偏最小二乘判别分析发现4个造成不同猪苓菌核质量差异性的主要标记物，依次是峰2、峰10、峰5、峰4，其中，峰10是麦角甾醇。