郭晓燕，毕蓉蓉，张晔敏，陆城华

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

肺动脉高压(Pulmonary hypertension，PH)是以肺血管阻力和肺动脉压持续性升高为特征的慢性肺血管疾病，以肺血管内皮功能障碍、平滑肌增殖、纤维化和原位血栓形成为特征，最终导致右心功能不全，甚至死亡，PH是多种并发症的产生的诱因，也是多种疾病发展到一定阶段后出现的病理性变化[1]。其发病机制复杂，治疗困难，预后差，严重程度甚至远远超过了癌症。据估计，与任何病因的PH相关的病死率为女性5.5/10万，男性5.6/10万，从诊断PH起平均存活时间为2～5年[2]。目前临床治疗PH药物包括肺血管扩张剂、内皮素抑制剂、NO激活剂等靶向药物，血管扩张剂可改善患者临床症状，未能有效降低患者病死率。靶向药物能够改善患者生存质量，远期疗效欠佳[3-4]，PH的1年病死率仍然高达15%[5]。PH病理特征是肺血管重构，表现在肺动脉血管内皮损伤、血管中膜增厚等，肺血管腔狭窄、管壁增生甚至血管闭塞，最终引起肺动脉压力增高[6-7]。因此，阻止及逆转肺血管结构重建是治疗PH的关键环节。既往研究显示，中药复方制剂可能通过调节血管舒张功能、保护肺血管内皮功能、抑制肺动脉平滑肌细胞增殖、抑制肺血管重构等机制以改善PH患者肺动脉压力、右心功能等[8-9]。PH属于中医“肺胀”“喘证”等范畴，早期病变首先在肺，早期以痰浊为主，渐而痰瘀互见，终至痰浊、血瘀等错杂为患。吴莹等[10]研究发现痰浊、瘀血是PH病情发展过程中的病理产物和致病因素，活血化瘀祛痰是治疗PH的重要原则。本文基于前期研究，拟采用活血化瘀祛痰法治疗PH，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康SD大鼠，SPF级，体重(200±20) g，饲养于上海中医药大学附属龙华医院动物房。动物许可证号SYXK(沪)2018-0036，环境温度(25±1)℃，湿度28%中适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 实验药物：①中药复方由川芎、赤芍、白芍、当归、丹参、黄荆子等组成，取上述药物制成液体制剂，其浓度为每毫升含生药量1.526 g，由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供。根据成人日服剂量，按动物体表面积比率换算等效剂量，日服量：8.64 g/(kg·d)。②盐酸法舒地尔注射液：规格2 ml:30 mg/支(天津红日药业有限公司)。

1.1.3 主要实验试剂与仪器：多道生理信号采集系统(成都仪器厂)；电泳仪(BIO-RAD公司)；转膜仪(BIO-RAD公司)；酶标仪(Thermo公司)；DMEM/F-12(Gibco)；抗生素(青链霉素)(Gibco)；FBS(Gibco)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶(Gibco)；超低温冰箱(Haier)；倒置显微镜(Olympus)；超净工作台(Baker公司)；Marker(Thermo公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备：采用野百合碱(MCT)腹腔注射建立肺动脉高压模型。大鼠腹腔内一次性注射MCT50 mg/kg，观察3周。

1.2.2 分组与给药：SD大鼠按随机数字表法随机分为四组，分别为假手术组、模型组、中药复方组、法舒地尔组，每组15只。各组均从第1天起开始给药，中药复方组给予中药 8.64 g/(kg·d)灌胃，法舒地尔组给予盐酸法舒地尔注射液15 mg/(kg·d)腹腔注射，假手术组和模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃，每日1次，持续3周。

1.2.3 取材与处理：脱臼法处死大鼠后取出肺脏，以0.9%氯化钠溶液冲洗后剪取右外上肺叶，浸泡于4% 多聚甲醛缓冲液固定，制备肺组织病理标本。

1.3 观察指标

1.3.1 一般状态：观察各组大鼠一般状态、体重、呼吸、活动状态。

1.3.2 肺动脉压：采用大鼠行右心导管术测定大鼠肺动脉压[11]，将大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，颈部正中作长约1.5 cm的纵行切口，并游离右颈外经脉约1 cm，结扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管经颈静脉缓慢插管至右心房、右心室及肺动脉，导管另一端连接压力传感器到生物信号采集系统，根据压力波形确定测导管位置，记录平均肺动脉压力(mPAP)。

1.3.3 右心指数：测定肺动脉压力结束后，立即完整取出心脏和肺脏，分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+S)，并依次称重，计算右心肥大指数(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.3.4 肺组织病理：大鼠右肺中叶组织4%多聚甲醛固定24 h，行HE染色观测模型肺组织的病理改变、维多利亚蓝+VG特殊染色观察肺血管重建指标。采用Image J图像分析软件测量血管内径(D1)、外径(D2)，计算肺动脉血管壁厚度百分比(WT%)，WT%=(D2-D1)/D2×100%。

1.3.5 ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表达：采用Western blot法检测。常规提取组织蛋白,使用考马斯亮蓝法进行蛋白定量,SDS-PAGE 电泳、转膜,一抗结合和二抗结合[一抗为鼠抗Rho 抗体(Thr696,1∶1500)、兔抗ROCK 抗体(1∶1000)抗体和兔抗DAPDH 抗体;二抗为生物素标记的山羊抗小鼠IgG 或者山羊抗兔IgG (1∶800稀释)],曝光、显影、定影。以GAPDH 为内参照,应用图像分析软件进行条带扫描分析,目的蛋白显色条带灰度与GAPDH 显色条带灰度比值代表目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行统计。数据以均数±标准差表示，对数据进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，不符合正态分布者，采用非参数检验；检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态及体重比较 注射MCT4周后大鼠一般情况发生变化，动物活动能力下降，毛发晦暗、缺少光泽，呼吸急促加快，易激惹，食欲下降，逐渐消瘦。模型组、中药复方组、法舒地尔组均已出现明显体重下降、呼吸急促等表现。结果显示，模型组较假手术组体重明显降低(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组体重较模型组升高(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠肺动脉压力比较 模型组mPAP明显高于假手术组(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组mPAP均低于模型组(P<0.01)，法舒地尔组与中药复方组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3 各组大鼠右心指数比较 模型组RVHI均明显高于假手术组(P<0.05)，中药复方组、法舒地尔组大鼠右心指数均低于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体重、右心指数、mPAP比较

2.4 各组大鼠肺血管重构比较 假手术组大鼠肺泡完整，肺小动脉血管壁光滑无增厚，管腔无狭窄，血管内皮细胞分布均匀，连续性完整；模型组大鼠肺中动脉血管壁明显增厚，管腔狭窄，中层平滑肌细胞增殖肥大、排列紊乱。模型组肺中动脉管腔狭窄、中膜增厚程度较对照组明显(P<0.01)，中药复方组、法舒地尔组血管增殖程度较模型组减轻(P<0.01)。见图1、2。

图1 各组大鼠肺动脉血管病理变化(HE染色，×400)

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图2 各组大鼠血管壁厚度百分比比较

2.5 各组大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ表达水平比较 与假手术组比较，模型组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均较假手术组明显升高(P<0.05或P<0.01)；中药复方组、法舒地尔组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)；中药复方组ROCKⅠ、ROCKⅡ水平与法舒地尔组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01图3 各组大鼠ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白水平表达比较

3 讨 论

PH患者肺动脉内皮细胞功能失调、PASMCs增生、肺血管收缩和原位血栓形成，导致组织缺氧，血液黏滞度增加，肺络瘀阻，呈现局部瘀血阻滞状态。徐欣等[12]基于文献研究显示，PH中医证候主要为肺肾气虚证、痰瘀阻肺证。翟佳滨等[13]认为气滞、痰阻、血瘀为本病的主要病理产物。从上述研究看出，PH属于本虚标实之病，痰瘀阻肺是其标，正气亏虚是其本证型，活血化瘀祛痰是其主要治疗原则。本研究方药由川芎、赤芍、丹参、当归、白芍等组成，具有活血化瘀、化痰止咳平喘等作用。现代研究显示，川芎有效成分川芎嗪具有保护血管内皮损伤、抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移等作用[14-15]。丹参酮ⅡA对PH的保护主要通过抑制肺血管异常收缩、肺血管重构，改善肺部血管炎症反应，改善右心室功能等发挥作用；芍药苷具有抗凝血、扩血管作用[16]；当归提取物当归注射液可抑制肺小动脉管壁增厚，降低肺血管压力[17]。MCT在体内经肝脏代谢成为有生物活性的脱氢野百合碱，选择性地引起肺动脉内皮细胞损伤和凋亡，促进内源性NO的合成分泌降低，缩血管物质释放增加，导致肺动脉持续收缩，诱导肺动脉血管重构，导致PH[18]。MCT诱导的PH模型可见明显血管内皮细胞损伤、肺动脉血管平滑肌细胞增殖、动脉管壁明显增厚，肺血管重构[19]。本研究显示,经MCT腹腔注射诱导后，模型组大鼠动物活动量减少，呼吸急促加快、烦躁，食欲下降，体重减轻，肺动脉压力、右心指数均较假手术明显升高，肺血管WT比例较假手术组增加，中药复方组、法舒地尔组均较模型组大鼠体重升高，肺动脉压力、右心指数下降，肺血管WT比例降低，表明中药复方能够降低MCT诱导的PH，减轻右心负荷，抑制肺动脉血管的增殖。导致肺动脉高压血管重构的机制有K+离子通道、Rho激酶信号通路、BMP信号通路等[20]，其中Rho激酶相关通路在肺血管重构中具有重要作用，Rho激酶存在两种同源性极高的异构体形式 (Rokα/ROCKⅠ 和Rokβ/ROCKⅡ)，激活的Rho 激酶可对其底物肌球蛋白磷酸酶进行磷酸化修饰，引起细胞骨架重组，促进血管平滑肌收缩，平滑肌细胞的迁移、增殖，导致肺动脉高压血管重构[21]。Rho激酶信号介导PASMC和EC中的细胞骨架重排，Rho激酶(ROCK)信号通路在介导所有PH模型中的血管收缩中起核心作用，Rho激酶抑制剂能防治MCT诱导的和基因易感型的大鼠PH，从而改善内皮依赖性的血管舒张，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖并促进其凋亡，促进肺血管收缩和肺血管结构重建，参与PH的发病过程。本研究显示，MCT诱导后，与假手术组比较，模型组ROCKⅠ、ROCKⅡ表达明显增加，给药后中药复方组、法舒地尔组ROCKⅠ、ROCKⅡ表达水平较模型组明显下降，中药复方组与法舒地尔组比较，差异无统计学意义，表明活血化瘀祛痰法可以抑制Rho激酶信号通路的激活，抑制PH血管重构。