缪晓杰 ,桂定坤 ,陈玉强 ,吕 荣 ,李道鸿 ,杨绪枫

(1.苏州市第九人民医院老年科,江苏苏州 215200;2.上海交通大学附属第六人民医院肾内科,上海 200233)

据统计[1],我国糖尿病患病率为9.7%,且呈快速增长趋势,已成为严重的公共卫生问题。其中30%～40%的糖尿病患者最终进展为糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN),糖尿病肾病是糖尿病全身性微血管病变表现之一,也是最严重、危害最大的慢性并发症之一。

研究发现,足细胞损伤在DN 发生发展过程中起重要作用。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞,它附着在肾小球基底膜外侧,是肾小球滤过膜的重要组成部分[2]。DN 时受损的足细胞对ECM 的生成调节紊乱,造成Ⅳ型胶原等基膜样基质增加,导致肾小球硬化,加速DN 的进展[3]。因此,改善高糖环境下足细胞凋亡对防治糖尿病肾病具有重要意义。

黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)是黄芪主要活性成分之一,也是《中国药典》2005年版用以控制其药材质量的指标成分[4]。我们的前期研究[5]显示,AS-IV 可显著改善糖尿病肾病大鼠肾组织病理损伤,减轻尿白蛋白。此外,AS-IV 能够通过VEGFR2/GIV 通路保护嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤[6];黄芪甲苷能够保护体外高糖刺激足细胞免受氧化应激的影响[7]。但是,关于黄芪甲苷保护高糖诱导足细胞损伤的具体机制尚未明确。本研究进一步讨论AS-IV是否对高糖诱导的足细胞损伤及线粒体功能障碍具有保护作用,并探讨其潜在的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

小鼠肾足细胞(MPC-5)购自舜冉(上海)生物科技有限公司,RPMI-1640 培养基、胎牛血清(FBS)购自Thermo Fisher Scientific(中国),黄芪甲苷购自成都普瑞法科技有限公司(中国),CCK-8试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、ATP 检测试剂盒以及DAPI染色液购自碧云天生物技术有限公司(上海),JC-1线粒体膜电位荧光探针购自上海翊圣生物科技有限公司(中国),Bcl2兔单克隆抗体、Bax兔单克隆抗体、cleavedcaspase 9兔多克隆抗体、cleaved-caspase 3兔单克隆抗体、Nephrin兔单克隆抗体、Podocin 兔单克隆抗体、Jagged1兔单克隆抗体、Notch1兔单克隆抗体、Hes1兔多克隆抗体、Hey1兔多克隆抗体、GAPDH 兔多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白IgG二抗均购自Abcam(美国)。

1.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验

根据CCK-8试剂盒制造商提供的说明书检测细胞活性。简而言之,将细胞以5×104/孔分组接种在不同处理条件下的96孔板当中,培养24 h后。每孔加入10μL CCK-8试剂,37℃避光孵育3 h,酶标仪检测450 nm 波长处的光密度值。

1.3 细胞分组培养与处理

细胞在含100 mL/L FBS的RPMI-1640培养基,37℃50 mL/L CO2条件下培养。将处于对数生长期的MPC-5细胞分为对照组(control 组,含5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育细胞24 h)、等渗对照组(MA组,含5mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇的培养基共孵育细胞24 h)、高糖诱导组(HG组,含30 mmol/L葡萄糖培养基孵育细胞24 h)、低剂量AS-IV与高糖共处理组(含30 mmol/L葡萄糖+5μg/mL AS-IV 的培养基共孵育细胞24 h)、中剂量AS-IV 与高糖共处理组(含30 mmol/L 葡萄糖+15μg/m L AS-IV 的培养基共孵育细胞24 h)、高剂量AS-IV 与高糖共处理组(含30 mmol/L 葡萄糖+30μg/m L AS-IV 的培养基共孵育细胞24 h),筛选出最佳的黄芪甲苷作用浓度用于后续实验。

1.4 TUNEL染色

将各组细胞收集并用PBS洗涤1次后,40 g/L多聚甲醛室温固定细胞30 min。PBS洗涤1次去除多余固定液,用含3 mL/L Triton X-100的PBS,室温孵育5 min。PBS洗涤2次后,加入50μL TUNEL检测液,37℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次后,加入少量DAPI染色液(覆盖住细胞即可),室温放置3～5 min,用PBS洗涤2次,每次3～5 min。最后用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下重点观察代表细胞凋亡的绿色荧光信号。

1.5 Western blotting检测相关蛋白的表达水平

将各组细胞收集并用预冷的细胞裂解液冰浴裂解10 min,提取总蛋白。BCA 蛋白定量试剂盒进行定量分析,加入6×SDS loading buffer,105℃孵育10 min,获取变性的细胞总蛋白。每孔加入50μg蛋白在100 V 条件下SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h分离总蛋白。将分离的蛋白在60 V 条件下转膜2 h,将蛋白转到NC膜上。随后用50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h,加入按比例稀释后的一抗4℃孵育过夜,用TBST 充分洗涤NC 膜2～3次后,加入按比例稀释后HRP标记的二抗室温孵育1 h,在黑暗环境下加入ECL 反应液进行发光反应,利用凝胶成像仪拍摄蛋白质印迹,最后采用Image J(v.1.8.0)软件分析蛋白的相对表达水平。

1.6 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位

收集各处理组细胞,加入足够覆盖所有细胞的预先配置好的JC-1工作液,37℃50 mL/L CO2条件下孵育15 min。弃去细胞培养液,并用PBS洗涤细胞2次后,加入2 mL细胞培养液并置于荧光显微镜下使用514 nm 激发波长,529 nm 发射波长检测JC-1单体绿色荧光信号以及使用585nm激发波长、590 nm 发射波长观察JC-1聚合物红色荧光信号。

1.7 试剂盒检测ATP含量

收集各处理组细胞,按照6孔板每孔加入200μL裂解液的比例加入裂解液,裂解细胞,取上清,用于后续的测定。将100μL预先配置好的ATP 检测工作液加到检测管内,室温放置3～5 min后,加入20μL样品,迅速用微量移液器混匀后,用化学发光仪测定相对发光单位RLU 值。根据预先测定好的标准曲线计算样品中ATP的浓度。

1.8 统计学方法

所有实验均进行3次平行实验,并用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,并采用Tukey进行事后检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-IV提高高糖下调的MPC-5细胞活力

如图1所示,我们首先检测AS-IV 对MPC-5细胞的细胞毒性,实验结果发现,分别用5、15、30μg/mL的AS-IV处理后,对细胞活性没有明显影响(P＞0.05)。和control组相比,HG组细胞活性降低(P＜0.001),而用AS-IV 处理后,提升高糖诱导的MPC-5细胞活性(P＜0.05),并随药物浓度梯度依赖性增加。由于30μg/mL AS-IV 处理的效果最为明显,故而选择30μg/mL AS-IV处理进行下一步研究。

图1 AS-IV提高高糖诱导的MPC-5细胞活力Fig.1 AS-IV enhanced the viability of MPC-5 cells induced by high glucose

2.2 AS-IV抑制高糖诱导的MPC-5细胞凋亡

TUNEL染色检测细胞凋亡水平,结果如图2A所示,和control组相比,HG 组细胞凋亡水平增加(P＜0.001);和HG组相比,HG+AS-IV 组细胞凋亡水平降低(P＜0.001)。如图2B所示,和control组相比,HG组细胞抗凋亡蛋白(Bcl2)表达降低(P＜0.001),凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3)表达升高(P均＜0.001);和HG 组相比,HG+AS-IV 组细胞抗凋亡蛋白(Bcl2)表达升高(P＜0.001),凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9,cleaved-caspase 3)表达降低(P均＜0.001)。Nephrin、Podocin等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜丢失。如图2C 所示,和control组相比,HG组细胞Nephrin、Podocin表达降低(P均＜0.001);和HG 组相比,HG+AS-IV 组细胞Nephrin、Podocin表达升高(P均＜0.01)。

图2 AS-IV抑制高糖诱导的MPC-5细胞凋亡Fig.2 AS-IV inhibited apoptosis of MPC-5 cells induced by high glucose

2.3 AS-IV 改善高糖诱导的MPC-5 细胞线粒体功能障碍

结果如图3A 所示,和control组相比,HG 组细胞线粒体JC-1聚合物含量下降,JC-1单体含量升高(P均＜0.001);和HG 组相比,HG+AS-IV 组细胞线粒体JC-1 聚合物含量升高,JC-1 单体含量降低(P均＜0.001)。ATP 检测试剂盒结果显示,和control组相比,HG组细胞ATP 含量下降(P＜0.001);和HG组相比,HG+AS-IV组ATP 含量升高(P＜0.001)。

图3 AS-IV改善高糖诱导的MPC-5细胞线粒体功能障碍Fig.3 AS-IV ameliorated mitochondrial dysfunction in MPC-5 cells induced by high glucose

2.4 AS-IV抑制NOTCH 信号通路激活

结果如图4所示,和control组相比,HG 组细胞NOTCH 信号通路相关蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1)表达升高(P均＜0.001);和HG 组相比,HG+AS-IV组细胞NOTCH 信号通路相关蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1)表达降低(P均＜0.001)。

2.5 分子对接显示AS-IV靶向作用于Notch1蛋白

结果如表1所示,AS-IV 与Notch1蛋白之间存在结合位点,发现mode1 和AS-IV 结合效率最高。因此,选择mode1进行分子对接,结果如图5所示,AS-IV 能够作用在notch1 蛋白F109、V112、K127、L176、N227、L229、F241等氨基酸残基上。

表1 分子对接显示AS-IV与Notch1蛋白之间存在结合关系Tab.1 Molecular docking showed a binding relationship between AS-IV and Notch1 protein

图5 分子对接显示AS-IV与notch1蛋白的结合位点Fig.5 Molecular docking showed the binding site of AS-IV to notch1 protein

3 讨 论

糖尿病肾病属中医学 “消渴、虚劳、水肿”等疾病范畴。黄芪为豆科植物,是中医常用的“益气药”,具有补气升阳、益气固表、利水消肿、托疮生肌的功效,至今已有两千多年的药用历史,被广泛用于糖尿病及肾脏疾病的治疗。黄芪甲苷是黄芪主要活性成分之一,本研究探讨黄芪甲苷对足细胞活性和凋亡的影响,并进一步探究其潜在的作用机制。

本研究发现,高糖诱导足细胞后,细胞活性降低,凋亡水平升高,抗凋亡蛋白(Bcl-2)表达降低,凋亡蛋白(Bax、cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3)表达升高;而通过黄芪甲甘处理后能够改善高糖诱导的足细胞活性降低和凋亡。当足细胞受到损伤时,Nephrin和Podocin等足细胞相关蛋白在足细胞裂孔膜丢失,使肾小球滤过电荷屏障减弱,促进蛋白尿的发生;同时,足细胞内的Bcl-2、p53、NF-κB等凋亡通路可被激活,诱导足细胞凋亡[3,8]。本研究发现,高糖诱导足细胞Nephrin和Podocin蛋白丢失,足细胞损伤加重,而黄芪甲苷处理则能改善高糖诱导的足细胞Nephrin和Podocin蛋白丢失。

尽管糖尿病肾病的发病机制很复杂,但越来越多的证据表明,线粒体功能障碍在糖尿病及其并发症的发生发展中起着重要作用[9]。人糖尿病肾小管和肾小球中线粒体蛋白表达较少,其中足细胞对线粒体功能障碍很敏感[10]。有研究发现,在链脲佐菌素(STZ) 诱导的DN 动物模型和高脂肪饮食诱导的肾小球病变的动物模型中,足细胞线粒体均出现异常,表明足细胞线粒体功能障碍在DN 发病机制中的重要性[11-12]。还有研究发现,调节线粒体稳态,改善线粒体功能障碍,能够预防糖尿病肾病中的足细胞损伤[13-14]。本研究通过JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。在正常线粒体内,JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物,发出强烈的红色荧光;而在不健康的线粒体中,由于膜电位的下降或丧失,JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中,产生绿色荧光。结果发现,高糖诱导足细胞绿色荧光增强,ATP含量降低,而黄芪甲苷处理则增加红色荧光信号,ATP含量升高,表示黄芪甲苷能够改善高糖诱导的线粒体功能障碍。

许多研究表明,Notch信号通路的异常表达与糖尿病肾病及足细胞的具有密切关系。Notch通路在糖尿病肾病肾活检标本中以及db/db2 型糖尿病肾病模型中发现Notch通路被激活[15-16],而激活Notch通路促进糖尿病蛋白尿的发生[17-18]。靶向Notch能够通过抑制链霉菌素诱导的糖尿病小鼠中TGF-β/Smad3信号通路激活来减轻肾脏纤维化[19];MicroRNA-145-5p通过靶向Notch信号通路降低高糖诱导的足细胞凋亡[20]。本研究发现,黄芪甲苷能够抑制高糖诱导足细胞的Notch信号通路激活,并进一步通过分子对接实验发现黄芪甲苷和Notch1 具有结合位点,暗示黄芪甲苷通过直接与Notch1 配体结合,从而抑制Notch信号。

总而言之,本研究发现黄芪甲苷能够改善高糖诱导的足细胞损伤和线粒体功能障碍,并且其可能通过抑制Notch信号发挥上述作用。为防治糖尿病肾病提供新的治疗思路奠定理论基础。