李彦军 ,王宇星 ,杨嘉凯 ,章培军 ,李宛容 ,张 威 ,刘杨青,张年萍

(1.山西大同大学医学院免疫学研究所,山西大同 037009;2.山东大学基础医学院医学遗传学系,山东济南 250012)

心肌炎可以分为感染性和非感染性心肌炎两大类[1-2],患者主要表现为呼吸困难、胸痛、心律失常、心力衰竭、心肌收缩甚至是猝死,是导致青壮年猝死的主要原因[3-4]。已有临床试验结果证实,通过短期的免疫抑制治疗心肌病,患者的症状可以得到改善[3]。心肌炎患者通常会出现淋巴细胞亚群和巨噬细胞数量的改变以及抗体介导的损伤。实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)小鼠模型是目前研究心肌炎发病免疫机制最常用的实验模型[1]。

法舒地尔(Fasudil)ROCK 抑制剂在心血管疾病治疗中发挥着重要的作用[5]。在哺乳动物中,存在两种ROCK 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶同源物——ROCK1和ROCK2,在细胞的增殖、转移、凋亡和周期调控等多种生物学过程中发挥着重要作用[6]。此外,有研究表明,ROCKs在心脏生理学中也发挥重要作用,ROCKs在心脏肥大、纤维化和系统性高血压等多种心血管病理过程中异常激活[7]。NOTCH信号是一种高度进化保守的信号通路。NOTCH 受体家族由四种蛋白质(NOTCH1-4)组成。其配体有Delta-like 1、Delta-like 3和Delta-like 4,以及Jagged 1和Jagged 2[8]。NOTCH1决定T 淋巴细胞与B淋巴细胞命运的关键调节信号[8]。NOTCH1参与胸腺细胞发育的早期DN1、DN2和DN3阶段,在T 细胞的调节和分化中至关重要[9]。

由于心肌炎表现为胸痛、呼吸困难和心悸等症状,通常与冠状动脉疾病等常见疾病相似,因此常被忽视[10],寻找有效的预防和治疗方法显得尤其重要。本研究主要利用EAM 小鼠模型探究ROCK 抑制剂在治疗心肌炎的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 小鼠

40只5～6周龄Balb/c雄性小鼠,购买于华阜康生物科技有限公司。动物实验被山西大同大学医学与生物学伦理委员会批准。

1.2 主要材料及试剂

DMEM 培养基、青霉素和链霉素购买于Gibco公司,胎牛血清购买于AusGeneX 公司,Fasudil购买于Selleck公司,多肽(My HC-α614-629)购买于吉尔生物有限公司,完全弗氏佐剂购买于Sigma公司,培养皿和单细胞滤网购买于Corning公司,RIPA 细胞裂解液和蛋白酶抑制剂购买于碧云天生物科技公司,Trizol试剂、ECL化学发光检测试剂盒和逆转录酶购买于Thermo公司,2×SYBR Green I Marker Mix购买于Roche公司,Random Primer、引物和HE染液购买于生工生物工程(上海)股份有限公司,Masson染色试剂盒购买于索莱宝生物有限公司,DAB显色液购买于中杉金桥生物技术有限公司,Notch1(货号3608)和GAPDH(货 号5174)购买于CST公司,IL-6(货 号R1412-2)购买于华安生物科技有限公司。

1.3 EAM 小鼠模型构建及治疗

Balb/c雄性小鼠随机分为4 组,佐剂对照组、EAM 组、5 mL/L DMSO 对照组和Fasudil治疗组各10只。

佐剂对照组:在第1天和第8天腹股沟皮下多点注射总量为200μL 的佐剂稀释液(佐剂∶生理盐水=1∶1);EAM 组:在第1天和第8天两次免疫,在小鼠腹股沟皮下多点注射总量为200μL 含0.2 mg 多肽(My HC-α614-629)的免疫混悬液;5 mL/L DMSO 对照组:第8天开始,隔天在EAM 小鼠腹腔注射5 mL/L DMSO 生理盐水,直到21 d 处死;Fasudil治疗组:第8天开始,隔天在EAM 小鼠腹腔注射Fasudil 40 mg/(kg·d),直到21 d处死。

1.4 脾脏单个核细胞的获取

取小鼠的整个脾脏于PBS 溶液中充分研磨,PBS清洗5～8次,每次1 000 r/min离心5 min,然后用单细胞滤网过滤并1 000 r/min离心5 min,最后加入10 mL DMEM 培养基重悬后移入10 cm 培养皿中,37℃、50 mL/L CO2培养5 d,统计每组每只小鼠脾脏培养出的单个核细胞数量。

1.5 HE和Masson染色分析小鼠心尖组织的炎症浸润和纤维化程度

HE染色步骤参考文献[11]。小鼠心尖组织切片后染色和拍照,采用双盲法,2名病理学专家同时对小鼠炎症情况评分。评分分为5个等级,炎症浸润0～19%、20%～39%、40%～59%、60%～79%和80%～100%分别记为“0”“1”“2”“3”和“4”,根据评分对比分析各组小鼠心尖组织炎症浸润程度。

Masson染色:石蜡切片脱蜡至水,Weigert铁苏木素染液染色7 min;Masson蓝化液处理5 min后,水洗1 min;磷钼酸处理2 min,苯胺蓝染液染色2 min,乙醇脱水脱色3 min,二甲苯透明封片,显微镜拍照。利用Image J统计分析蓝色区域的比例,根据蓝色区域占比分析对比各组小鼠心尖组织纤维化程度。

1.6 免疫组化检测小鼠心尖组织IL-6的表达

免疫组化步骤参考文献[11]。小鼠心尖组织切片后染色和拍照,利用Image J统计分析棕色区域的比例,得染色区域的比例。

1.7 Western blotting检测Notch1和IL-6蛋白的表达

RIPA 裂解液提取细胞总蛋白,BCA 法蛋白定量后,使用40μg总蛋白变性后进行Western blotting,具体实验步骤参考文献[11]。Notch1(兔抗)1∶1 000,GAPDH(兔抗)1∶3 000,IL-6(兔抗)1∶1 000;二抗(兔抗或鼠抗)1∶5 000。

1.8 qRT-PCR检测Notch1和IL-6等基因的表达

Trizol提取RNA,逆转录及定量PCR步骤参考文献[11]。Gapdh为内参,根据2-△△Ct计算不同样品之间目的基因的表达差异。所用引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 各基因的引物序列Tab.1 Sequences of qRT-PCR primers of genes

1.9 统计学分析

利用GraphPad Prism 5,数据以Mean±SEM 导入处理,然后采用两组数据对比t检验计算P值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EAM 小鼠模型成功建立

EAM 组小鼠的心脏明显增大并且略显发白。称量每组小鼠的初始体质量、最后体质量和心脏重量发现,与佐剂对照组相比,EAM 组小鼠心脏重量明显增加,差异有统计学意义(图1A 和图1C,表2)。计算小鼠体质量的变化和心脏重量与体质量的比值,结果显示,EAM 组小鼠与佐剂对照组相比体质量明显减轻(图1B,表2),心脏重量与体质量的比值明显增大(图1D,表2),以上结果说明EAM 小鼠模型建立成功。

表2 佐剂对照组和EAM 组小鼠BW、HW 和HW/e-BW 的变化Tab.2 Changes of BW,HW and HW/e-BW in EAM group and control group

图1 与佐剂对照组相比EAM 组小鼠BW、HW 和HW/e-BW 的变化Fig.1 Changes of BW,HW and HW/e-BW in EAM group compared with control group

2.2 Fasudil处理改善EAM 小鼠的症状

与5 mL/L DMSO对照组相比,Fasudil治疗组小鼠心脏明显减小,称量小鼠的初始体质量、最后体质量和心脏的重量发现,Fasudil治疗组心脏重量明显减轻,且具有统计学意义(图2A 和图2C,表3)。计算两组小鼠体质量的变化和心脏重量与体质量的比值,结果显示,Fasudil治疗组小鼠与5 mL/L DMSO 对照组相比体质量明显增加(图2B,表3),心脏重量与体质量的比值明显升高(图2D,表3)。Masson染色结果显示,EAM 组小鼠与佐剂对照组相比蓝色占比明显增加,说明小鼠心肌组织纤维化明显增加且具有统计学差异,Fasudil治疗组小鼠与5 mL/L DMSO 对照组相比蓝色占比明显减少,说明小鼠心肌组织纤维化得到缓解且具有统计学差异(图2E和图2F)。以上结果说明,Fasudil治疗能够明显改善EAM 小鼠的症状。

表3 5 mL/L DMSO 对照组和Fasudil治疗组小鼠BW、HW和HW/e-BW 的变化Tab.3 Changes of BW,HW,HW/e-BW and myocardial tissue fibrosis in Fasudil-treated mice and 5 mL/L DMSO control group

图2 与5 mL/L DMSO 对照组相比Fasudil治疗组小鼠BW、HW、HW/e-BW 和心肌组织纤维化的变化Fig.2 Changes of BW,HW,HW/e-BW and myocardial tissue fibrosis in Fasudil-treated mice compared with 5 mL/L DMSO control group

2.3 Fasudil处理改善EAM 小鼠的炎症

HE结果显示,与佐剂对照组相比,EAM 组小鼠心肌组织炎症浸润明显增加,Fasudil治疗组小鼠与5 mL/L DMSO 对照小鼠对比心肌组织炎症浸润得到缓解,炎症评分均具有统计学差异(图3A 和图3B)。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞,单个核细胞数量的增加能够间接反映出机体的炎症状况。脾脏是小鼠最大的免疫器官,因此,分离培养小鼠脾脏单个核细胞能够反映小鼠的炎症情况。将小鼠整个脾脏研磨后培养发现,EAM组小鼠与佐剂对照组相比,单个核细胞的数量明显增加,Fasudil治疗组小鼠与5 mL/L DMSO 相比单个核细胞的数量明显减小,且均具有统计学差异(图3C)。

图3 Fasudil治疗能够降低EAM 小鼠心肌组织的炎症Fig.3 Fasudil treatment reduced myocardial tissue inflammation in EAM mice

2.4 Fasudil显著降低EAM 小鼠心肌组织中IL-6的表达

qRT-PCR 检测结果显示,EAM 组小鼠与佐剂对照组相比促炎因子IL-1α、IL-1β和IL-6均明显增加,且具有统计学意义,但Fasudil治疗后与对照组小鼠相比只有IL-6明显降低且具有统计学差异,而IL-1α和IL-1β 并无统计学差异(图4A、图4B 和图4C)。同时结果显示,EAM 组小鼠与佐剂对照组相比Tlr2 和Tlr4 均增加,Fasudil治疗后,Tlr2 和Tlr4均减小,但Tlr2具有统计学差异,Tlr4无统计学差异(图4D 和图4F)。以上结果显示,Fasudil可以改善EAM 小鼠的症状可能是通过降低促炎因子IL-6的表达而实现的,可能还与TLRs的活性抑制相关。

图4 qRT-PCR 检测促炎因子和TLRs信号通路关键基因的表达Fig.4 qRT-PCR detected the expressions of pro-inflammatory factors and key genes of TLRs signaling pathway

2.5 抑制NOTCH 信号通路降低IL-6的表达

Western blotting结果显示,在EAM 小鼠心肌组织中Notch1和IL-6的表达均增加,当使用Fasudil治疗后两者表达明显降低(图5A)。免疫组化进一步证实小鼠心肌组织中IL-6的表达结果和Western blotting结果一致(图5B 和图5C)。利用qRT-PCR检测了NOTCH 信号通路的下游靶基因,结果显示Notch1、Hes1和Jag2在EAM 小鼠心肌组织中的表达明显上调。经过Fasudil治疗后三者的表达均下调,但是Notch1和Hes1具有统计学差异而与Jag2没有统计学差异(图5D、图5E、图5F和图5G)。以上结果充分证实,Fasudil治疗EAM 小鼠降低促炎因子IL-6的表达是通过抑制NOTCH 信号通路实现的。

图5 Fasudil通过抑制NOTCH 信号通路的活性降低IL-6表达Fig.5 Fasudil reduced the expression of pro-inflammatory cytokine IL-6 by inhibiting the activity of NOTCH signaling pathway

3 讨 论

心肌炎是一种炎症性心脏疾病[1]。非感染性心肌炎由有毒物质和药物(如免疫检查点抑制剂)[12]、全身性免疫疾病等诱发[13]。不同类型心肌炎的病因、诱发和病程差异很大,是心肌炎治疗的重要挑战。

本研究发现,EAM 小鼠利用Fasudil治疗后,与治疗对照组小鼠相比,HW 降低,BW 增加,HW/BW降低,心肌组织的炎症浸润和纤维化程度减轻,脾脏单个核细胞数量明显减少等,证实Fasudil在EAM小鼠的治疗中发挥着重要的作用。进一步探究Fasudil发挥作用的机制,发现促炎因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的表达在EAM 小鼠心肌组织中均升高,Fasudil治疗后都有所下降,但IL-6 的变化最为明显,因此重点探讨了IL-6。结果显示,在小鼠的心肌组织中IL-6和Notch1的表达具有一致性,并且还发现NOTCH 信号通路的相关靶基因Notch1、Hes1和Jag2都有明显的变化。以上所有结果证实,Fasudil改善EAM 小鼠的症状是通过抑制NOTCH 信号通路的活性,进一步抑制IL-6的表达而发挥作用。

研究还发现,TRLs信号异常,尤其是Trl2 和Trl4,文献中已经有报道TRLs信号在自身免疫性疾病中发挥重要作用[14,15],因此,未来的研究可以重点向该方向探讨。此外,本研究重点探讨的是促炎因子,在免疫系统调节中促炎因子和抑炎因子都发挥着重要作用,因此,也可以从抑炎因子方面进一步探讨。本研究为Fasudil治疗心肌炎提供了一定的参考价值,相信Fasudil在未来的医学中应用的越来越广泛。