李秋兰 颜芙蓉 李彩苹 李永余 赵越真 郑小蔚 陈 津

（1 福建医科大学附属第二医院，福建 泉州 362000；2 晋江市医院检验科，福建 泉州 362200；3 福建省泉州市妇幼保健院儿童医院，福建 泉州 362000）

胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤，胃癌在全球的癌症发生率及病死率高居第5位及第4位。据报道，全球范围内90%以上的胃癌可以归因于H.pylori持续慢性感染导致的胃黏膜慢性炎症和损伤[1-2]。H.pylori作为慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌的主要致病因素，其被世界卫生组织归类为Ⅰ类致癌物，然而其具体致病机制仍不明确。目前还未有运用脂质组学的方法对幽门螺杆菌进行分析的报道，本文采用脂质组学与快速、高通量、高精度的质谱技术，结合病理以及免疫印迹方法，比较在胃癌发展的不同阶段、以及不同细菌类型的结构组成变化，以探讨不同毒性的幽门螺杆菌的对胃黏膜侵袭与致病性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 所有病例均为来自福建医科大学附属第二医院进行胃镜检查的患者，其中男性21例，女性10例，平均年龄（52.40±18.86）岁。知情同意并签署知情同意书，本研究已获得我院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 空腹采静脉血3 mL，分离血清，操作遵照试剂盒说明书进行。免疫印迹法检测血清中的H.pylori抗体，包括抗Vac A、抗Cag A、抗Ure A及抗Ure B抗体。根据H.pylori抗体分型检测结果将抗Vac A和（或）抗Cag A阳性分为Ⅰ型，仅抗Ure B和（或）抗Ure A阳分为Ⅱ型，抗Vac A、抗Cag A、抗Ure A及抗Ure B均为阴性，即为H.pylori感染阴性。

1.2.2 胃黏膜组织病理学 取胃黏膜组织固定于中性甲醛溶液中，常规脱水、石蜡包埋、切片，HE染色后光镜下观察胃黏膜组织细胞形态学变化。

1.2.3 分离培养 活检标本接种于H.pylori选择性血平板（HpSBP）上，置微需氧培养罐，再置37 ℃培养箱中用5% O2和10% CO2及85% N2的混合气体进行培养。培养到第5天，观察是否有典型幽门螺杆菌菌落。如果有阳性菌落，进行革兰染色镜检，观察细菌形态，同时进行尿素酶、氧化酶和触酶等检测；若无菌落生长，则继续培养至第7天，仍无菌落生长判定为阴性结果。

1.2.4 脂质组学

脂质提取：①每例各取H.pylori菌落6～8个置1.5 mL管中，用PBS液洗涤二次，用液氮淬灭后，置37 ℃与-80 ℃间进行5次反复冻融裂解细菌后，加入225 µL甲醇及标准品，以最大速度涡旋10 s。②加入750 µL甲基叔丁基醚，以最大速度涡旋10 s，室温静置30 min。③加入188 µL质谱级水，涡旋20 s，室温静置10 min，4 ℃条件下，15000 rpm离心15 min，取700 µL上清液于新EP管中。④氮吹仪吹干上清液，加入100 µL回收液（异丙醇∶乙腈∶水=30∶65∶5），10 s涡旋后，4 ℃条件下，14000 rpm离心10 min，吸取上清液于样品管。⑤采用LC-MS质谱仪进行检测。每个待测样本各取等量体积混合成质控样本（QC），用来校正混合样品分析结果的偏差以及由于分析仪器自身原因所造成的失误，用剩余待测样本进行LC-MS检测。

将培养出27例H.pylori菌进行脂质组学试验。先进行脂质提取，再上机检测。

色谱条件：仪器采用Thermo Ultimate3000，使用ACQUITY UPLC® BEHC18色谱柱（1.7 µm、2.1 mm×100 mm），自动进样器温度设为8 ℃，以0.3 mL/min的流速，50 ℃的柱温，进样2 μL进行梯度洗脱，流动相为：水（0.1%甲酸+10mM甲酸铵）（A）-异丙醇∶乙腈=2∶5（0.1%甲酸+10mM甲酸铵）（B）。

质谱条件：仪器使用Thermo Q Exactive Focus，电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气流速30 arb，辅助气流速10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率35000进行全扫描，扫描范围150～2000 m/z，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

数据处理：经LC-MS检测，所获得的原始质谱数据导入美国Thermo公司的Lipid Search 4.0软件，进行峰提取和预处理；再将数据导入Microsoft Excel 2010软件进行归一化处理。然后将筛选的数据导入瑞士Umetrics公司SIMCA14.0软件进行多元统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。根据OPLS-DA模型中变量投影重要性（VIP）值＞1筛选变量，并结合t检验的P值（P＜0.05）寻找差异性脂质代谢物。

1.3 统计学分析 采用 SPSS19.0软件进行统计分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义；对于显著偏态分布的资料的组间比较采用Mann-WhitneyU检验。

2 结果

2.1 病理学 炎症18例（伴糜烂8例、溃疡10例）；萎缩/化生者7例；肿瘤6例（腺癌5例，鳞癌1例）。HE染色可见胃壁细胞肿大、坏死，伴有明显的炎症浸润；部分病例伴有肠异生、萎缩。

2.2 血清H.pylori抗体分型 总阳性率为70.10%。Ⅰ型：表达为抗体Cag A、Vac A、Ure A 及Ure B均阳性占24.50%；表达为Cag A/Vac A+Ure A/Ure B 阳性占25.5%。Ⅱ型：表达为抗体Ure A、Ure B均阳性占9.70%；表达为Ure B或Ure A阳性占6.40%及3.20%。阴性组为Cag A、Vac A、Ure A及Ure B均为阴性。将抗体分型结合病理诊断进行分组。见表1。

表1 H. pylori分型与病理关系[n（%）]

2.3H.pylori培养 共31例，其中4例培养无菌落生长。菌落为无色、透明、针尖状；涂片经革兰染色检查呈革兰阴性、S形或弧形弯曲状菌体；脲酶、氧化酶、触酶均为阳性。

2.4 脂质组学

2.4.1 不同病理异变组的H.pylori脂质成分 按组织活检病理诊断的严重程度进行分组分析：无异变组即无组织类型改变者，共12例，包括炎症、糜烂、溃疡者；异变组即存在异型病理变化，共15例，包括萎缩/化生者9例、肿瘤6例（腺癌5例、鳞癌1例）。按脂质类别及类别中占10%以上的主要组分列出H.pylori的脂质谱，共筛选出有明显差异的18种脂质，具有统计学差异（P＜0.05）。见表2。

表2 不同病理异变组的H.pylori主要脂质成分

图1 按是否异变分组的H.pylori脂质组学PCA分析散点图

置换检验（图4.2B）r2＝（0.0，0.836）、Q2＝（0.0，-0.175）、无过拟合存在，表明该模型符合样本数据的真实性，并可以很好地解释两组样本间的差异。

图2 按是否异变分组的病例H.pylori脂质组学多元分析散点图

2.4.2 按是否异变分组的病例H.pylori的差异组分筛选 按异变分组的H.pylori具体组分经多元分析按VIP数值大小列图3。

图3 按是否异变分组的病例H.pylori脂质组分差异分布

同时将异变组中的化生和肿瘤组进行成组t检验，发现TAG54:1-FA20:0和CE(16:0)组分在两组间的表达具有显著性差异，VIP＞1且P＜0.05。见表3；直观关系热图见图4。

表3 不同分层的异变病例H. pylori差异组分

图4 不同分层的异变病例H. pylori差异组分热图

3 讨论

本研究对31例在本院接受胃镜检查的患者进行幽门螺杆菌培养，血清H.pylori抗体分型检测，组织块病理检查，以及将培养出的H.pylori进行脂质组学分析。与抗体Ⅱ型组比较，抗体Ⅰ型组胃黏膜组织进行HE染色可见胃壁细胞肿大、坏死，伴有更明显的炎症浸润；同时伴有肠异生、萎缩等。抗体Ⅰ型包括抗CagA抗体、抗VacA抗体。而CagA、VacA是慢性感染幽门螺杆菌的毒力因素，也是胃癌的危险因素[3]。H.pylori在胃疾病发展中的作用已完全确立[4-5]，H.pylori的致病性与CagA、VacA相关[6-8]。但不是所有H.pylori菌株都会有CagA的表达，且CagA几乎只出现在VacA表达阳性的H.pylori患者中[7]。VacA是一种穿孔毒素，可识别靶细胞表面的受体并穿过细胞膜发挥其空泡毒性[8-10]。本次研究发现，Ⅰ型抗体阳性的H.pylori患者在胃肠道异变中具有更高的阳性率，而且其所致胃部损伤程度更为严重。因此，血清H.pylori的Ⅰ型抗体可作为临床H.pylori感染后的治疗指征。

本研究又将不同病变阶段的胃组织异变程度的胃黏膜培养出H.pylori进行了脂质组学的研究，发现了18个主要脂质类成分。其中，具有明显差异的脂质是以C18和C16碳链为主的LPC、LPE、PE、PC、CE、CER、DAG、SM和TAG等脂质。CE（16:0）的表达降低，且具有统计学意义。虽然剩余脂质的表达也有所降低，但均无统计学差异。我们又将胃黏膜异变的化生组与肿瘤组进行差异脂质进行比较发现，CE与TAG在肿瘤组表达更高。H.pylori的TAG比例的不断提高，一方面提示胃黏膜异化后的局部环境不利于H.pylori生存，脂滴储存的致病菌有利于保持感染状态、使其对寄生部位胃组织持续刺激及毒害；另一方面，研究发现胃细胞癌化时与细胞代谢及增殖相关的脂肪酸结合蛋白表达上调[11]、脂质合成功能增强[12-13]、游离脂肪酸、三酰甘油和总胆固醇等含量升高[14]，癌细胞在人体内的生存依赖脂质、在多种癌症微环境中都发现积累的脂滴[14-45]，H.pylori高水平的TAG可促进肿瘤的发生与发展。CE（16:0）水平能充分反应胃组织类型改变时的H.pylori整体脂质状态，可以作为今后H.pylori表观性状的风向指标、降低临床研究成本。胆固醇酯（cholesterol ester，CE）是胆固醇（cholester）在转运和储藏过程中的主要存在形式，二者变化趋势相似；它既可类似于TAG在细胞内合成，也可经H.pylori吸收菌外游离胆固醇（FC）后的转化[16-17]。作为磷脂双层的骨架组成之一，高水平胆固醇提升了细胞膜的稳定性、降低了水溶性物质的通透性[18]，也可增强膜脂屏障和（或）逃避宿主免疫系统能力[19-20]，属于H.pylori在恶劣条件下生存的有利因素。

胃黏膜由炎症到化生再发展到肿瘤的胃上皮表现与试验结果一致，故推测CE与TAG与H.pylori的致病相关，CE/TAG组分可能与CagA/VacA小泡成分或H.pylori菌体上的分泌功能结构相关。

综上所述，H.pylori的致病强弱与H.pylori的脂质成分相关，差异性脂质代谢物，如CE、TAG等为进一步深入研究胃疾病的致病机制提供了方向，但它们如何参与疾病的进程和具体的作用，以及是否所有的胃疾病患者都存在相同的差异性脂质代谢物仍然需要大样本的试验来进一步明确。