施小妹 余幼芬 陈艳琴 徐雪汝 刘荣国△

（1 福建省立医院疼痛科，福建医科大学省立临床医学院，福州 350001； 2 厦门大学附属妇女儿童医院麻醉科，厦门 361003）

神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是源于躯体感觉神经系统的损害或疾病所导致的疼痛，疼痛可持续存在或反复发作[1]，是亟待解决的重大医学难题。目前认为，NP 发生发展的重要机制与外周和中枢神经系统敏化有关。外周神经损伤后，伤害性感受信息经背根神经节 (dorsal root ganglion,DRG) 整合后传入脊髓背角，激活脊髓背角小胶质细胞产生多种生物活性物质，诱发中枢敏化，促进NP 的发生、发展，而抑制脊髓小胶质细胞下游活性介质的形成、释放则能明显减轻NP[2]。这些活性介质主要包括细胞因子、趋化因子和脂质介质等[3]，根据功能可分为致炎及抗炎因子，致炎因子常见为肿 瘤 坏 死 因 子-α (tumor necrosis factor α, TNF-α)、IL-1β 和干扰素等，抗炎因子常见为白介素-10 (interleukin-10, IL-10)、IL-4 及肿瘤坏死因子结合蛋白等[4,5]。鉴于脊髓背角内的免疫炎性反应在促发中枢敏化中发挥重要作用，且研究已证实TNF-α 可诱导其他炎症因子发生级联反应，参与NP 的形成与维持，而IL-10 可逆转其作用，两者交互作用以平衡神经炎症[6]。因此，本研究以脊髓背角内的炎症反应为切入点，探讨抑制脊髓背角内的炎症反应而改善NP，具有重要的研究意义。

脉冲射频 (pulsed radiofrequency, PRF) 是目前临床治疗NP 的一种非损伤或微损伤的神经调控介入技术，可通过抑制胶质细胞活化、突触传递和炎症因子的改变来实现治疗目的[7]。虽然标准PRF 具有操作简单，并发症少，创伤小且即时治疗效果突出等优点，但是标准PRF 的远期疗效不稳定，常需多次治疗。近年来，许多学者针对更加有效的PRF模式进行探索，发现高电压模式可提高PRF 的治疗效果[8,9]。然而，PRF 的输出电压与疗效之间的量效关系，尚缺乏随机、对照的基础试验研究，高电压PRF 镇痛机制的相关基础实验鲜见。本实验拟复制坐骨神经分支选择性损伤 (spared nerve injury, SNI)大鼠模型，采用不同电压PRF 大鼠DRG，通过观察大鼠疼痛行为学改变和脊髓背角内TNF-α 和IL-10的表达变化，研究不同电压PRF 干预DRG 治疗NP是否存在差异及其与TNF-α 和IL-10 的相关关系，为未来临床推广应用高电压PRF 治疗NP 提供实验依据。

方 法

1.实验动物和分组

2.模型制备

（1）按照Decosterd 等[10]的方法制备大鼠SNI模型：大鼠全身麻醉后暴露左坐骨神经主干分支，于分支处近端结扎其分支胫神经、腓总神经，远端剪断，保留并避免损伤腓肠神经，逐层缝合肌肉和皮肤。Sham 组仅暴露左后肢坐骨神经后游离其分支胫神经和腓总神经近分叉段。

（2）大鼠DRG 的PRF 治疗，于神经损伤后第7 d 进行。大鼠全身麻醉后暴露左L5DRG 后，将射频仪（COSMAN RF-G4，美国）的负极板贴于大鼠足底，射频治疗套管针（长度10 cm，裸露端5 mm）置于DRG 上，取出针芯，插入电极（见图1）。设定治疗模式：温度42℃，脉率2 Hz，脉宽20 ms，持续时间2 min ×3 循环，电压分别为45 V、65 V、85 V、100 V。SPRF 组：制模后第 7 d，仅在左L5DRG 放置射频电极，无PRF 治疗。

图1 SNI 大鼠DRG 的PRF 治疗Fig. 1 Pulsed radiofrequency of dorsal root ganglion of SNI rats

3. 疼痛行为学观察和测量

在制模前测量各组大鼠基础阈值，制模后 1 d、3 d、5 d、7 d，PRF 后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 实施行为学测定和机械刺激缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 测量。所有测定均在固定时间 (8:00～12:00, am) 和安静环境下进行。

运动功能：观察所有SD 大鼠自然状态下随意行走的步态，采用记分制：1 分：正常步态、足无畸形；2 分：正常步态伴明显足畸形；3 分：轻度步态障碍伴足下垂；4 分：严重步态障碍伴肌无力。将评分 4 分的大鼠剔除。

MWT 测量：以Dixon 等[11]up and down 法测定 MWT，将有机玻璃箱置于金属筛网上，大鼠适应10 min 后，以vonFrey 针丝（Stoeling 公司，美国）垂直刺激大鼠术侧后足掌部，避开爪垫，持续时间≤4 s，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定从2 g 开始，当该力度刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度刺激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度刺激，如此连续进行，直至出现第1 次阳性和阴性反应，再连续测定 4 次，取平均值为阈值。最大力度为15 g，大于此值时记为 15 g。每次刺激间隔30 s，每次测量时使尼龙丝弯曲到相同的弧度，以确保每次施加的刺激相同。

4. 脊髓背角内TNF-α 和IL-10 的表达

制模后第14 d、21 d 每组处死大鼠各5 只，采用免疫荧光和Western blot 检测脊髓背角内TNF-α和IL-10 表达水平。

（1）免疫荧光法：大鼠腹腔麻醉，开胸经心脏灌注 4% 多聚甲醛。分离脊髓并取出 L4-6脊髓背角，并用刀片在非手术侧划一缺口作为标记，固定12 h后，样本置于石蜡中包埋，切片，片厚 5 µm。采用等距随机抽样法，抽取5张用于免疫荧光染色。脱蜡，EDTA 抗原修复缓冲液(pH 8.0)微波修复 15 min，冷却至室温，依次加入3%血清工作液封闭 30 min后，甩掉封闭液，直接加入一抗：兔抗鼠 IL-10 抗体（ab9969，abcam，英国），兔抗鼠 TNF-α 抗体（ab6671，abcam，英国），4℃孵育过夜，滴加羊抗兔二抗 IgG （武汉赛维尔生物科技有限公司，中国），覆盖组织，避光室温孵育50 min，磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗 3 次，滴加DAPI 染液，避光室温孵育10 min，加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min，抗荧光淬灭封片剂封片，光学显微镜（Nikon，日本）观察。使用Image J 软件（National Institutes of Health 公司，美国）分析免疫荧光强度。

（2）蛋白质免疫印迹法：大鼠腹腔麻醉后，迅速取 L4-6节段脊髓背角，置于液氮中保存待测。测试时，取出脊髓组织放入匀浆器，加入 RIPA 蛋白裂解液1.0 m1，冰上机械匀浆裂解30 min 后4℃、12,000 rpm 离心10 min，小心吸取上清，采用 BCA 法测定蛋白样品浓度，上样缓冲液稀释蛋白样品后沸水浴变性15 min，等量蛋白样品经 10%SDS PAGE 凝胶电泳分离后，蛋白以湿转法电转移至 PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，IL-10 抗体（ab9969，abcam，英国）、β-actin 抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，中国）、TNF-α 抗体 （ab6671，abcam，英国）孵育，4℃轻摇过夜，加入辣根氧化物酶标记物的羊抗兔 IgG（1:3000，武汉赛维尔生物科技有限公司，中国），室温孵育30 min，按照发光试剂盒（Thermo 公司，美国）的说明进行放射自显影，使用Image J 软件（National Institutes of Health 公司，美国）分析条带光密度值，以目的蛋白条带光密度值与相应β-actin 条带光密度值的比值反映蛋白表达水平。

科技企业要加大自主研发投入，加快融入全球研发创新体系，增强整合创新资源能力，加快提升自主创新能力和核心竞争力，在相关领域积极抢占主导地位，建立领跑优势。各地要围绕强化企业技术创新主体地位，推动创新政策、创新资源、创新人才、创新服务向企业集聚，大力培育创新型领军企业和高新技术企业，重点培育一批瞪羚企业、独角兽企业、平台型企业，形成更具规模的创新型企业集群。

5. 统计学分析

采用 SPSS 20.0 统计学软件进行分析，符合正态计量资料以均数±标准差(±SD)表示，MWT采用双因素重复测量方差分析 (two-way repeated measures ANOVA)，并进行组间各时间点的比较。TNF-α 和IL-10 的表达量采用单因素方差分析 (oneway ANOVA)，组间两两比较采用 LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1.疼痛行为学观察

（1）一般行为学观察：除Sham 组外，其余6组大鼠在SNI 后术侧足趾并拢轻度外翻，下肢行走无力，评分均为 2 分。术侧后爪偶然接触笼面会发生明显的缩足反应。术前各组大鼠之间体重无明显差异，术后各组大鼠体重正常增长，差异无统计学意义（P> 0.05，见图2）。

图2 各组SNI 大鼠PRF 前后的体重变化(n = 20,±SD)Fig. 2 Weight changes of SNI rats before and after PRF (n = 20,±SD)

（2）MWT：除了Sham 组，其余6 组大鼠于SNI 后第 1 d 即出现 MWT 下降，与Sham 组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。SNI 组与SPRF组各同时间点MWT 比较，差异无统计学意义。与SNI 组比较，4 个PRF 组在PRF 后各时间点的MWT 均升高(P＜0.05)，但仍低于Sham 组(P＜0.05)。45VPRF 组与100VPRF 组比较，MWT 差异无统计学意义。与45VPRF 组比较，65VPRF 组在SNI 第8 d 后各时间点的MWT 升高(P＜0.05)，但显著低于85VPRF 组（P＜0.05，见图3）。

图3 不同电压PRF 大鼠SNI 模型DRG 对术侧MWT的影响(n = 20,±SD)Fig. 3 Eあects of diあerent voltage PRF of DRG on the MWT of left foot in rats with SNI (n = 20,±SD)

2.免疫荧光法检测脊髓背角内TNF-α 和IL-10的表达

与Sham 组比较，其余6 组大鼠在SNI 后14 d和21 d TNF-α 的表达均明显增强，而IL-10 的表达均明显减弱(P＜0.05)。SNI 组与SPRF 组的TNF-α、IL-10 表达水平在SNI 后14 d、21 d（即PRF 后第7 d、14 d）差异均无统计学意义。在SNI 后14 d、21 d，与SNI 组比较，4 个PRF 组TNF-α 表达均明显减弱(P＜0.05)，而IL-10 的表达均明显增强(P＜0.05)。在SNI 后14 d、21 d，45VPRF 组与100VPRF 组TNF-α、IL-10 的表达比较，差异无统计学意义。在SNI 后14 d、21 d，与45VPRF 组比较，65VPRF 组TNF-α 的表达减弱，而IL-10 的表达增强(P＜0.05)。85VPRF 组和65VPRF 组在SNI 后14 d IL-10 的表达比较，差异无统计学意义。在SNI 后14 d、21 d，与另外3 个PRF 组比较，85VPRF 组TNF-α 的表达最弱，在SNI 后21 d，85VPRF 的IL-10 的表达增强最显著（P＜0.05，见图4、5）。

图4 免疫荧光法检测各组大鼠脊髓背角中 TNF-α 和IL-10 的表达Fig.4 Expression levels of the TNF-α and the IL-10 in spinal cord horn among diあerent groups by immunofluorescence analysis

3.蛋白质免疫印迹法测定脊髓背角内TNF-α 和IL-10 的表达

图5 不同电压PRF 大鼠第14 d 和21 d 的脊髓背角内TNF-α 和IL-10 的表达比较(n = 5,±SD)Fig.5 Expression levels of TNF-α and IL-10 in the spinal dorsal horn of rats in diあerent groups on day 14 and day 21 after SNI (n = 5,±SD)

与Sham 组比较，其余6 组大鼠在SNI 后第14 d和21 d TNF-α 的表达均明显增高，IL-10 的表达均明显减弱(P＜0.05)。SNI 组与SPRF 组的TNF-α、IL-10 表达水平差异均无统计学意义。与SNI 组比较，4 个PRF 组 在SNI 后14 d、21 d TNF-α 表 达均明显减弱，IL-10 的表达均明显增强(P＜0.05)。在SNI 后14 d、21 d ，45VPRF 组与100VPRF 组的TNF-α 和IL-10 的表达比较，差异无统计学意义。在术后21 d，与45VPRF 组比较，65VPRF 组TNF-α的表达减弱，IL-10 的表达增强(P＜0.05)。在SNI后14 d，85VPRF 组和65VPRF 组IL-10 的表达比较，差异无统计学意义。在SNI 后14 d、21 d，与另外3 个PRF 组比较，85VPRF 组TNF-α 的表达均最弱；在SNI 后21 d，85VPRF 组的 IL-10 的表达最显著（P＜0.05，见图6）。

图6 Western blot 法检测各组大鼠脊髓背角内TNF-α 和IL-10 蛋白表达(n = 5,±SD)Fig.6 Expression levels of the TNF-α and the IL-10 in spinal dorsal horn among diあerent groups by Western blot (n = 5,±SD)

讨 论

本研究复制大鼠SNI 模型，发现以DRG 为靶点实施不同电压PRF 均能有效改善SNI 大鼠的MWT，下调脊髓背角内TNF-α 和上调IL-10 的表达。与45VPRF 组 和100VPRF 组 比 较，65VPRF 组 和85VPRF 组的MWT 改善、TNF-α 表达下调和IL-10表达上调更为显著，其中85VPRF 组最为显著。本研究是首次报道有关高电压PRF 大鼠DRG 通过调控脊髓背角内TNF-α 和IL-10 的表达这一抗炎途径发挥镇痛作用，丰富了高电压PRF 模式产生良好镇痛疗效的相关机制研究。

本研究选用的是SD 大鼠 SNI 模型，SNI 组坐骨神经损伤后5～7 d 疼痛反应达高峰并在随后观察时间内维持稳定，这与Hu 等[12]的研究结果一致。大鼠SNI 后第7 d 于DRG 实施 PRF 治疗，PRF 后第1 天即开始出现MWT 的回升，至治疗后14 d 内仍保持稳定，且接受不同电压PRF 的4 组在SNI 第8 d 后各时间点的MWT 均有明显上升，表明PRF 对NP 治疗有效。45VPRF 组与100VPRF 组MWT 均有明显上升，但两组差异无统计学意义。与45VPRF 组和100VPRF 组比较，65VPRF 组、85VPRF组的MWT 上升程度更为显著，其中85VPRF 组的MWT 上升最为显著，说明高电压65 V、85 V 的PRF 应用于DRG 治疗NP 的效果优于45 V（标准电压），高电压PRF 能进一步提升疗效。而继续提高电压至100 V时，对NP 的改善程度并没有进一步扩大，相关机制需要进一步研究确认。

NP 发生发展的重要机制是外周敏化和中枢敏化[13]。DRG 在外周敏化过程中起重要作用，被认为是NP 的一个重要靶点[14,15]。PRF 干预DRG 能够有效治愈NP 已经被大量临床及基础实验证实，故本研究的PRF 靶点选择为DRG。脊髓是疼痛信息传递和整合的初级中枢，在中枢敏化中发挥重要作用，脊髓背角接受DRG 神经冲动传入，并将信息传递至上位中枢，现已证实当外周神经损伤后，脊髓背角接收异常兴奋的初级感觉神经元信号，引起脊髓中小胶质细胞活化进而释放免疫炎性物质，诱导形成NP[1,15]，即脊髓背角内的免疫炎性反应在促发中枢敏化中发挥重要作用，因此本研究重点选择观察脊髓背角内的炎症反应。

TNF-α 作为重要致炎因子，通过调控上下游各通道、细胞因子等参与NP 的产生与维持[16]。本研究表明，不同高电压的PRF 均能起到缓解NP 的效果，但不同高电压PRF 抑制SNI 大鼠的TNF-α 表达的程度各不相同，其中以85VPRF 组抑制TNF-α表达最优，结合其MWT 的变化发现，TNF-α 表达下调越明显，其MWT 上升越显著，这与他人的研究结果一致[7]，证明了脊髓背角内TNF-α 参与了NP 的形成和发展，高电压PRF 可能通过不同程度下调TNF-α 表达而减轻NP。

新近研究提示，脊髓背角内TNF-α 和IL-10 在内的关键抑炎细胞因子共同调节神经炎症，IL-10可能是通过抑制促炎因子合成和释放从而有效减轻NP[5,17]。本研究中，随着NP 的发展，IL-10 表达逐渐下调，而接受PRF 干预后，4 个不同电压PRF组的IL-10 表达均上调并伴随着MWT 的回升，其中以85VPRF 组的IL-10 上调最为明显，因此，高电压PRF 可能通过不同程度上调IL-10 表达而减轻NP。值得注意的是，在SNI 后第14 d，对65VPRF组和85VPRF 组脊髓背角内IL-10 表达进行比较并未观察到统计学差异，可能IL-10 是炎症晚期细胞因子，其对炎症以及高电压PRF 治疗的效果可能存在部分延迟，后期才表达增强并保持稳定。

本研究仍存在不足，首先仅在SNI 后第14 d和第21 d 测定脊髓背角内TNF-α 和IL-10 的表达，虽然发现两者的表达与NP 密切相关，但没有增加时间点以动态观察脊髓背角内TNF-α 和IL-10 表达的整体变化趋势，且未进行更长时间的观察，故无法判断高电压PRF 相比标准PRF 远期的疗效如何。其次，本研究设置最高电压为100 V，结果显示，85VPRF 组是缓解NP 最佳电压，当电压增加到100 V时，对NP 的改善并没有得到进一步的缓解，其具体机制尚不明确，未来我们将进一步探讨研究不同电压PRF 是否能不同程度改善DRG 的超微结构、促进神经修复而产生不同疗效，以及针对其内在的其他机制进行更深入的研究。

综上所述，高电压PRF 大鼠SNI 模型DRG 可下调脊髓背角内TNF-α 表达，上调IL-10 表达，从而减轻NP，而85 V 的PRF 镇痛疗效优于其他电压，这为临床选择高电压PRF 治疗NP 提供了实验支持依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。