李 洋, 蒋立峰, 孙 旭, 刘怀民

(郑州大学附属肿瘤医院 中西医结合科, 河南 郑州, 450008)

肺癌是全球发病率和病死率最高的癌症之一[1], 其中非小细胞肺癌 (NSCLC)是最常见的肺癌类型。在亚洲患者中，携带表皮生长因子受体 (EGFR)突变的NSCLC患者约占51.7%[2]。研究[3]表明，相比于传统化疗，吉非替尼可以显著提高EGFR阳性突变患者的客观缓解率 (ORR), 延长无进展生存期 (PFS), 改善其生活质量。但EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)继发性耐药也是一个不可忽视的问题。

免疫检查点抑制剂 (ICIs)开辟了癌症治疗的新领域。研究[4]表明，在前线治疗失败的患者中，与多西他赛相比，帕博利珠单抗有更好的长期获益。多种ICIs, 如纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗等已被批准用于无驱动基因突变NSCLC的二线或一线治疗[5]。但携带EGFR突变的晚期NSCLS患者在靶向治疗失败后，后线治疗使用免疫治疗疗效较差, ORR、PFS及OS均低于EGFR野生型患者。因此，本文主要探讨了EGFR信号通路在肿瘤免疫微环境中对抗肿瘤免疫应答的影响和预后指标、EGFR突变患者的免疫治疗现状及目前正在进行的临床实验。

1 EGFR 信号通路

EGFR与其配体表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双向调节蛋白 (AR)、β-细胞素和肝素样生长因子结合时, EGFR与其他ERBB家族成员(ERBB2、ERBB3或ERBB4)形成同二聚体或异二聚体，刺激内源性受体酪氨酸激酶活性，并在这些酶的细胞质调节域内触发特定酪氨酸残基的自磷酸化。磷酸化酪氨酸残基激活几个下游信号途径，包括MAPK途径(RAS-RAF-MEK-ERK)、PI3K/AKT途径(PI3K-AKT-mTOR)、STST途径(JAK-STAT)，这些途径促进细胞增殖、迁移和转移、逃避凋亡和血管生成[6]。

2 程序性细胞死亡受体-1 (PD-1)/程序性细胞死亡配体-1 (PD-L1)通路

PD-L1广泛表达于各种细胞类型中，主要分布于肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤 (NK)细胞、树突状细胞 (DCs)和活化的T细胞中。PD-1是一种表达于T细胞上的免疫检查点蛋白，活化T细胞表达的PD-1与肿瘤细胞上表达的PD-L1相互作用，产生负反馈抑制T细胞激活，导致T细胞无法识别肿瘤细胞，实现肿瘤免疫逃逸，并且增强调节性T细胞 (Tregs)的激活，维持免疫稳态，防止自身免疫[7-8]。PD-1/PD-L1单抗阻断PD-1和PD-L1的相互作用，恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫作用，杀伤肿瘤细胞。

3 肿瘤微环境 (TME)

TME是一个决定肿瘤生长、侵袭和转移的动态网络，由肿瘤细胞、免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞、各种细胞因子及趋化因子构成。与非恶性组织相比，TME具有缺氧、低pH值和高组织间液压的特点，这可以降低几乎所有类型的抗癌治疗的有效性，包括免疫治疗，并促进肿瘤进展和增加治疗耐药性[9]。因此，有可能通过改善肿瘤微环境来提高抗癌治疗(化疗、放疗、免疫治疗、靶向治疗)疗效。肿瘤免疫涉及抗原呈递细胞 (APCs)对肿瘤抗原的捕获和处理, APCs向引流淋巴结迁移以引导T细胞，以及致敏T细胞向肿瘤迁移，在肿瘤中其发挥细胞毒性抗肿瘤作用。

4 EGFR信号通路和抗肿瘤免疫

4.1 主要组织相容性复合体 (MHC)

MHC对于将肿瘤抗原呈递给T细胞具有重要作用。经典MHC可分为MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子。CD8和CD4糖蛋白作为辅助受体起作用，帮助T细胞抗原受体识别由MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子呈递的抗原肽。MHC-Ⅰ分子几乎位于所有哺乳动物细胞的表面，可以被CD8+T细胞识别，为CD8+T细胞提供抗原信息。MHC-Ⅱ分子主要由专职抗原呈递细胞如DCs、B细胞和巨噬细胞表达，向CD4+T细胞呈递外源衍生的肽抗原，激活CD4+T细胞，帮助对抗感染和癌症的各种免疫反应[10]。EGFR已被证明是多种癌症中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表达和抗原呈递机制的负调控因子。一些关注EGFR信号传导和MHC分子之间相互作用的研究[11]表明, EGFR 配体-EGF和TGF-α会降低MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子的表达。EGFR下游P13K-AKT和MAPK-ERK通路抑制MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ以及其他重要抗原呈递成分的表达，包括与抗原加工相关的转运蛋白1(TAP1)、TAP2和β2微球蛋白。另一方面，在EGFR突变的肺癌细胞株中，干扰素-γ (INF-γ)在体外显著下调MHC-Ⅰ类分子的表达。

4.2 树突状细胞

树突状细胞是功能最强APCs, DCs在TME及抗肿瘤免疫中发挥重要作用，激活初始CD4+T细胞和CD8+T细胞分化为具有不同功能的抗原特异性T细胞。肿瘤有吸引并重新编程DCs的生物学特性，诱导其发挥免疫抑制和促血管生成的功能。肿瘤相关细胞因子如血管内皮生长因子 (VEGF)、白介素 (IL)-10、TGF-β和前列腺素 (PG)-E2可以改变DCs的特性[12]。VEGF-A可诱导DCs前体向血管的内皮样分化和迁移，促进血管生成[13]。IL-10可以抑制DCs的成熟, TGF-β和PEG2促使DCs分化为调节性DCs, 抑制CD4+T细胞增殖[12]。EGFR信号通路的激活对于致耐受性DC的产生至关重要。相关研究分析了TCGA数据库中585例患者，发现未成熟DCs在EGFR 19del、L858R和罕见突变中逐渐增加。体外实验[14]显示, EGFR 19del突变型肺癌细胞通过外泌体摄取抑制DCs的功能，来自EGFR 19del肺癌细胞的外泌体可有效将活性EGFR 19del转移到DC的表面，诱导无能DCs。

4.3 肿瘤浸润淋巴细胞

肿瘤浸润性T淋巴细胞是影响免疫治疗疗效的关键因素。LIU S Y等[15]研究了715例肺癌患者的肿瘤标本，发现在EGFR突变或ALK重排的患者中, PD-L1+/CD8+肿瘤的比例显著低于野生型患者。此外, ZHAO C等[16]检测了190例手术肺腺癌样本中的CD8+T细胞和凋亡，发现EGFR突变的CD8+T淋巴细胞的比例显著低于野生型患者，同时发生凋亡的比例更高。相比于野生型患者，肿瘤浸润性T淋巴细胞缺乏可能是EGFR突变患者对于PD-1/PD-L1单抗疗效差的主要原因。

4.4 免疫抑制细胞

免疫抑制中的主要参与细胞为表达叉头框转录因子P3 (FoxP3)的Tregs细胞，表达CD11b和Gr1的骨髓源性抑制细胞(MDSC)，和M2极化的肿瘤相关巨噬细胞 (TAMs)。肿瘤逃逸免疫应答的一个主要机制是招募Tregs细胞进入肿瘤微环境。Treg细胞能够抑制CD4+T细胞及CD8+T细胞的活化和增殖、效应T细胞的功能、细胞因子的产生、B细胞的增殖和免疫球蛋白的产生、NK细胞和NKT的细胞毒性作用，并且抑制DC细胞的功能和成熟[13]。研究[17]表明, EGFR突变NSCLC肿瘤微环境中有大量Tregs细胞浸润，在转染了EGFR 19del的小鼠模型中，通过JNK-cJun通路上调趋化因子CCL22的表达，促进Tregs细胞在肿瘤微环境中的浸润。ZHU G S 等[18]通过对TCGA数据库中收集肺腺癌数据集进行分析，发现与EGFR野生型肺腺癌患者相比, EGFR突变患者的CD4+T/CD8+T细胞数量增加。

TME中促进肿瘤免疫逃逸的另一重要的免疫抑制细胞是MDSC。这些细胞包括一群处于不同分化阶段的异质表型未成熟髓样细胞。EGFR过表达诱导CCL2、VEGF、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和TGF-β等细胞因子的表达，招募和激活MDSC[19]。在EGFR突变的NSCLC患者外周血中，MDSC数量显著提高。MDSC同时是EGFR-TKI不良反应的预测因子，可能是通过其非典型NF-κB/RelB通路激活TAM引起的[20]。

TAMs是成熟的M2极化巨噬细胞，可分泌多种细胞因子如VEGF、PDGF、IL-10、集落刺激因子(CSF)-1和趋化因子如CCL2、CCL5, 促进新血管生成，调节炎症反应和适应性免疫来发挥促肿瘤作用[21]。TAMs通过直接产生EGF激活肿瘤细胞上的EGFR信号通路，上调周围肿瘤细胞的VEGF/VEGFR信号，促进血管生成，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移[21], 并且分泌IL-8, IL-8激活Src/STAT3/ERK1/2介导的EGFR, 促进TKI耐药[22]。PEI B X等[23]通过检测266例肺腺癌患者CSF-1、EGFR和CD68的表达，发现CSF-1和EGFR在肿瘤中的表达水平与间质性TAMs的浸润程度呈正相关。提示EGFR阳性NSCLC可以通过减少TIL的浸润，增加Treg细胞、MDSC、TAMs的浸润，形成非炎症表型TME, 对免疫治疗缺乏有效反应。

4.5 EGFR和肿瘤分泌抑制性细胞因子

EGFR突变的癌细胞过度分泌免疫抑制分子，如TGF-β、IL-10、VEGF、吲哚胺-2, 3-双加氧酶、精氨酸酶1和腺苷，直接抑制NK细胞杀伤、DCs成熟和细胞毒性T淋巴细胞功能和增殖[13]。在EGFR突变的肿瘤中, CD73/腺苷途径上调，T细胞、巨噬细胞、DCs、MDSC等免疫细胞均表达抑制性腺苷A2A受体 (A2AR)。肿瘤微环境中高浓度的腺苷可作用于A2AR, Tregs细胞和MDSC的浸润、免疫抑制活性都会增强，而DCs、效应T细胞、NK细胞和NKT细胞的活性会受到抑制[24]。EGFR信号通路激活cJun/cJun N末端激酶，并降低干扰素调节因子-1, 前者招募Treg细胞，而后者诱导CD8+T细胞浸润[25]。

5 EGFR突变NSCLC患者免疫治疗疗效预测标志物

5.1 肿瘤突变负荷(TMB)

癌细胞含有产生非自身蛋白的体细胞突变，适应性免疫系统识别为“非自身”新抗原。新抗原负荷和T细胞浸润密切相关。TMB是肿瘤抗原性的一个标志物，为每百万碱基中检测到的体细胞基因编码错误、碱基替换错误和基因插入或删除错误的总数。在不同类型的癌症中，对于接受ICIs治疗的患者，高TMB与更高的ORR、更长的PFS及OS相关[26- 27]。在晚期肺腺癌患者中, EGFR突变患者的TMB低于野生型，导致对ICIs的临床反应受损[28]。研究[29]表明，相比于19 DEL突变，携带L858R突变的NSCLC似乎具有更高的TMB和对ICIs更好的反应率。LI L等[30]通过对TCGA的5个癌症队列研究发现，与TP53野生型癌症相比，TP53突变的癌症更有可能具有更高TMB, 当EGFR合并TP53突变时，对于免疫治疗可能有更高的反应率和生存时间。

5.2 PD-L1

PD-L1广泛分布于不同类型的细胞中，除此之外，PD-L1也存在于外泌体表面，被称为外泌体PD-L1。肿瘤来源的外泌体PD-L1结合了外泌体和PD-L1的特点，可将PD-L1从PD-L1阳性的肿瘤细胞转运到PD-L1阴性的肿瘤细胞[31]。PD-L1是ICIs治疗的重要预测生物标志物。相关研究[26]通过对晚期NSCL患者的组织标本进行PD-L1检测，发现PD-L1表达增加可作为晚期NSCLC患者疗效和OS的阳性生物标志物。有研究[13]结果表明, EGFR突变通过PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK或JAK-STAT3途径上调PD-L1, 诱导T细胞凋亡。在体外细胞实验[32]中, EGFR-TKI抗性细胞中YAP和PD-L1的表达水平显著升高, Hippo途径效应子YAP的过表达直接上调PD-L1的表达。D′INCECCO A等[33]分析了125例NSCLC患者PD-L1表达，其中包括了56例EGFR突变患者，发现PD-L1表达水平与EGFR突变之间存在显著正相关性。在体内和体外实验[11]中, EGFR-TKI可降低EGFR突变NSCLC中PD-L1表达。但LIU S Y等[15]检测了715例肺癌患者的组织标本，发现EGFR突变或ALK重排患者PD-L1+/CD8+表达比例(5.0%)低于野生型患者(14.2%), PD-L1-/CD8-表达比例(63.5%)高于野生型患者(50.3%)。基因分型不同, PD-L1表达水平也不同。在亚组分析[34]中, EGFR 19DEL突变患者的PD-L1表达高于EGFR L858R突变。T790M阴性患者更可能在EGFR-TKI治疗后受益于纳武利尤单抗，可能是由于PD-L1表达水平高于T790M阳性患者[35]。对101例接受TKI的EGFR突变阳性NSCLC患者进行回顾性分析，发现在15例原发耐药的患者中, PD-L1阳性率明显高于TKI获得性耐药患者[36]。上述研究中观察到不一致的现象可能与既往治疗(如EGFR-TKI)对PD-L1 表达水平的影响、癌症临床分期相关。PD-L1表达与EGFR及其亚型之间的关系还需要进一步研究验证。

6 EGFR突变患者免疫治疗

6.1 PD-1/PD-L1单抗单药治疗

根据GAINOR J F等[37]的研究，免疫单药治疗后, EGFR+/ALK+组的客观反应率ORR和中位PES分别为3.6%和2.07个月, EGFR-/ALK-组的ORR和中位PFS分别为23.3%和2.58个月。MAZIERES J等[38]的一项回顾性研究探索了免疫单药疗法对携带驱动基因突变患者的疗效，结果显示EGFR突变阳性患者疗效最差, ORR为12%, 中位PFS为2.1个月。一项Meta分析[39]比较了PD-1/PD-L1抑制剂与多西他赛治疗晚期NSCLC的疗效和安全性，包括了CheckMates 057、KEYNOTE-010和POPLAR 3项临床实验，结果表明在EGFR阳性人群中，多西他赛组疗效优于免疫治疗。一系列研究表明，对于EGFR阳性突变患者ICIs单药疗效较差。

6.2 联合EGFR-TKI

EGFR-TKI可以通过重塑TME和提高ICIs的效益，调节对癌症的免疫应答-抑制免疫抑制细胞的活性，如Tregs细胞和MDSC，并抑巨噬细胞M2极化，促进DC细胞对肿瘤抗原的摄取，刺激肿瘤特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的扩增和激活，增强INF-γ对MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子的诱导作用，促进T细胞介导的肿瘤杀伤，抑制CD73等免疫抑制因子[25, 40]。临床前研究表明, EGFR-TKI联合ICIs有临床获益的可能性。但临床试验表明, EGFR-TKI与ICIs联合使用往往会导致更严重的免疫相关不良反应。KEYNOTE-021 2期试验中，7例入组接受帕博利珠单抗联合吉非替尼治疗的患者中，有5例患者出现3/4级肝毒性[41]。I期开放，多中心试验(NCT02088112)招募了56例NSCLC患者，度伐利尤单抗联合吉非替尼的毒性大于任何1种药物单一使用。此外，与对照组相比，联合治疗组并未显示更高的PFS和OS获益[42]。从理论上讲, EGFR突变患者可以从EGFR-TKI和ICIs联合治疗中获益，但目前的临床试验提示联合方案不良反应较严重，因此，双药联合方案还需进一步研究。

7 免疫治疗联合其他药物治疗

7.1 联合化疗

相关研究招募了6例EGFR突变患者以评估纳武单抗联合化疗在一线治疗中的疗效。但EGFR突变组的中位无进展生存期(mPFS)和OS 短于野生型组[43]。CT18研究[44]是一项评估特瑞普利单抗联合化疗治疗EGFR-TKI耐药，以及为T790M阴性晚期NSCLC疗效和安全性的II期临床研究，结果显示ORR为50%, DCR为87.5%, mPFS为7个月，与对照相比，特瑞普利单联合化疗较单药免疫治疗可以提高患者的PFS和ORR。LIU S T等[45]评估58例患者EGFR-TKI耐药后化疗联合免疫化疗的临床疗效，联合免疫疗法可显著延长患者PFS, 以及OS更长。

7.2 联合抗血管生成靶向药

异常的肿瘤血管是影响特异性TME形成的主要因素之一。异常的肿瘤血管有助于形成免疫抑制环境。肿瘤血管正常化可将肿瘤的免疫抑制微环境转化为免疫促进微环境，并通过增加血流量和氧合来改善各种免疫治疗的结果。VEGF是影响肿瘤血管生成的重要细胞因子，在EGFR突变的NSCLC中，上调的EGFR信号通过非缺氧依赖性机制增加VEGF[26], 从而促进肿瘤异常血管的生成。联合抗血管生成靶向药物可以改善肿瘤内MHC-I、Th1、T效应标志物和趋化因子，改善抗原特异性T细胞迁移。

IMpower150是一项开放Ⅲ期研究，其比较了128例接受阿替利珠单抗联合贝伐及化疗(ABCP)后较贝伐联合化疗(BCP)在转移性NSCLC患者中的疗效。与BCP组相比，无论PD-L1表达和EGFR/ALK基因改变状态如何,ABCP组ORR高达71%, PFS和OS均显著延长[46]。相关数据[47]显示，接受PD-L1抑制剂和抗血管生成加化疗的患者具有更好的临床结果, ORR为73.5%(贝伐单抗加化疗组为40.9%), mPFS为10.2个月(贝伐珠单抗加化疗组为7.1个月)。

7.3 双免疫治疗

细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白 (4CTLA-4)单抗在T细胞发育早期的活化阶段作用于淋巴结，通过解除抑制T细胞活化的信号，从而维持T细胞激活状态。而PD-1/PD-L1单抗则主要在T细胞成熟后的效应阶段作用于肿瘤微环境，通过阻断淋巴结中PD-L1与PD-1分子的相互作用，增强T细胞启动与活化。双免疫联合治疗可以改善治疗免疫微环境及增强INF-γ的产生、调节上皮间充质转化及血管生成[48]。相关研究[43]招募了8例EGFR突变患者，给予纳武单抗联合伊匹木单抗作为一线治疗策略, 8例患者中有4例达到客观缓解，而EGFR野生型患者的ORR为41%。有临床实验招募了10例经EGFR-TKI治疗后的EGFR突变患者，给予帕博利珠单抗和伊匹木单抗，只有1例患者达到了客观缓解[49]。Ⅲ期临床实验数据[50]显示，无论TMB或PD-L1表达水平如何，纳武单抗联合伊匹木单抗的总生存期均有所改善。

8 结 语

EGFR突变NSCLC患者对ICI治疗疗效不理想与非炎症表型TME及缺乏免疫原性相关。虽然单药及联合EGFR-TKI疗效不佳，但是随着更多的临床实验进行，免疫联合化疗、抗血管生成靶向药及双免疫治疗为EGFR突变患者带来了新的方向，但同时也面临以下挑战: ① 对于EGFR突变患者, PD-L1、TMB、基因亚型都会影响免疫治疗的疗效，因此免疫治疗的最佳目标人群的选择对于免疫治疗的成功至关重要。② 如何选择最佳的联合方案、药物剂量和给药顺序以获得最大的疗效和最小的不良反应。目前临床实验显示, EGFR突变患者可能会从PD-1/PD-L1单抗联合治疗中获益，但仍需进一步探索以明确最佳用药方案，以期为肺癌患者带来更大获益。