何梦蝶 陈家铃 罗丹 陈丹 洪延涵 刘卫

研究白梅花油/白藜芦醇纳米乳（双白纳米乳）的黑素细胞摄取和美白功效。采用流式细胞仪，研究小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）对双白纳米乳的摄取行为。采用体外细胞模型和3D黑素皮肤模型，评价双白纳米乳的细胞和皮肤组织模型美白功效。结果表明，双白纳米乳可显著提高B16F10细胞的摄取，显著抑制酪氨酸酶活性、减少黑色素生成及增强细胞抗氧化作用，效果优于同剂量游离活性物。3D黑素皮肤模型研究结果显示，与阴性对照相比，双白纳米乳能够显著提高表观色度，提升黑素模型的L*值，降低黑素模型黑素含量，效果与阳性对照曲酸相当。研究表明，双白纳米乳作为新型美白功效原料具有良好的应用前景。

关键词：白梅花油/白藜芦醇纳米乳；黑素细胞摄取；3D黑素皮肤模型；美白功效评价

皮肤内黑色素含量决定肤色深浅，酪氨酸酶被视为黑色素合成过程中的关键酶，抑制该酶活性直接影响黑色素合成量，抑制酪氨酸酶活性是目前肌肤美白研究和应用的重要手段[1]。白梅花为蔷薇科植物梅（Prunusmume（Sieb.）Sieb.etZucc.）的干燥花蕾，白梅花油具有抗血小板凝聚、抗抑郁、抗氧化和防止黑色素沉积的作用，其化学成分主要有挥发油类、黄酮类以及苯丙素类等[2]。白藜芦醇是存在于葡萄、虎杖及桑椹等植物中的天然多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗衰老等生物学效应[3]，研究表明，白藜芦醇作为一种安全有效的天然植物美白剂具有较好的开发价值和应用前景[4]。

纳米乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例通过高压匀质等技术制备，呈透明或半透明状的油水混合体系[5]。纳米乳作为皮肤给药载体具备诸多优势，如纳米乳中的表面活性剂可显著增加脂溶性药物溶解度，从而增大药物在皮肤上的浓度梯度；油相和表面活性剂具有皮肤促渗作用；水相能增加角质层水化，提高药物经皮渗透能力，包载活性物可经毛囊等附属器渗透进皮肤等[6，7]。功效化妆品活性成分需要进入皮肤，按其功效需要作用于皮肤活性表皮或真皮，并在该部位积聚和发挥作用[8]。基于本团队前期护肤功效成分纳米载体研发工作基础[9，10]，本文构建了共载负白梅花油/白藜芦醇纳米乳——双白纳米乳，并对双白纳米乳的黑素细胞摄取行为及细胞和3D黑素皮肤模型的美白功效进行研究和评价，以期为新型美白护肤品的开发提供实验依据。

01材料与仪器

1.1实验材料

白梅花油，浙江英树生物科技有限公司；白藜芦醇，陕西慧科植物开发有限公司；三辛酸/癸酸甘油酯，英国禾大；PEG-40氢化蓖麻油，日本日光化学；1，3-丙二醇、甘油，国药集团化学试剂有限公司；异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明B（RhoB）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素、胰酶，美国Gibco公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒，购自日本东仁化学科技有限公司；3%H2O2、α-促黑素细胞激素（α-MSH）、左旋多巴，购自Sigma公司。小鼠黑色素瘤细胞（B16F10），人角质形成细胞（HaCaT），购自中国科学院昆明细胞库。

1.2主要仪器

高速剪切仪，德国IKA公司；AMH-3微射流高压均质机，安拓思纳米技术（苏州）有限公司；Zetasizer/Nano-ZS90纳米电位粒径分析仪，英国Malvern公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；BB150CO2培养箱，美国Thermo公司；CytoFLEX流式细胞仪，美国BeckmanCoulter公司；FV3000激光共聚焦显微镜，日本Olympus公司；多标记酶标仪，美国PerkinElmer公司。

02实验方法

2.1双白纳米乳的制备

称取处方量白梅花油、白藜芦醇、PEG-40氢化蓖麻油、1，3-丙二醇和三辛酸/癸酸甘油酯为A相，另称取处方量甘油溶于适量超纯水中为B相，分别于50℃下恒温水浴溶解，磁力搅拌15min后匀速将B相加入A相中，边加边搅拌，继续搅拌30min，采用微射流高压均质机均质溶液后即得到得双白纳米乳。

2.2粒径、PDI、Zeta电位

取適量双白纳米乳，超纯水稀释一定倍数，用纳米电位粒径分析仪测定粒径、多分散系数（Polymerdispersityindex，PDI）和Zeta电位，粒径测定角度为90°，测试温度为25℃。

2.3细胞摄取研究

2.3.1流式细胞仪检测细胞摄取行为

称取适量FITC代替活性物作为荧光标记，制备FITC纳米载体，并配置等浓度的游离FITC。将B16F10细胞以每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板中，孵育24h后，弃去旧培养基，每孔加入含相同浓度FITC的游离FITC、FITC纳米载体，以未经任何处理的细胞作为阴性对照，继续培养2h和4h后，用冷PBS洗涤细胞，胰酶消化，离心，收集细胞沉淀然后重悬于0.5mL冷PBS溶液中，用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。

2.3.2激光共聚焦显微镜观察细胞摄取行为

将处于对数生长期的B16F10细胞，以每皿3×105个细胞的密度接种于共聚焦皿中培养24h后，加入含有FITC的游离FITC、FITC纳米载体的DMEM培养基分别孵育2h和4h。孵育后弃去培养基并用PBS溶液洗涤细胞3次，然后依次用罗丹明B溶液染色、4%多聚甲醛固定和DAPI溶液染色各15min，使用激光共聚焦显微镜在100倍物镜下观察拍照。

2.4细胞美白功效评价

2.4.1细胞内酪氨酸酶活性测定

采用L-Dopa氧化法测定细胞内酪氨酸酶的活性[11]。取B16F10以1×105个/mL接种于24孔板中培养24h。按照实验分组加入100nMα-MSH进行诱导（除正常对照组），构建α-MSH诱导的黑色素高表达模型。再加入500μL含有不同浓度的游离活性物（含有与双白纳米乳相同浓度的白梅花油和白藜芦醇混合溶液）和双白纳米乳的DMEM完全培养基，对应白藜芦醇的浓度为2、8和32μg/mL，培养48h后，弃去上清液，用PBS清洗3次，每孔加入含1%TritonX-100的PBS缓冲液300μL，置于-80℃冰箱中冷冻1h，随后室温融化，将细胞裂解液在12000rpm离心20min，收集上清液。取上清液60μL于96孔板中，加入140μL的0.1%L-Dopa，37℃孵育1h，于490nm波长处测各孔的吸光度。

2.4.2细胞黑色素检测

采用NaOH裂解法测定细胞内黑色的含量[12]。取B16F10细胞以5×104个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，培养24h。按照实验分组加入100nMα-MSH进行诱导（除正常对照组），构建α-MSH诱导的黑色素高表达模型，再加入500μL含有不同浓度的游离活性物和双白纳米乳的DMEM完全培养基，对应白藜芦醇的浓度为2、8和32μg/mL。培养48h后，弃去上清液，用PBS清洗3次后，每孔加入300μL的1mol/LNaOH溶液（含10%DMSO），在80℃充分裂解细胞1h，于405nm波长处测各孔吸光度。

2.4.3细胞抗氧化检测

参照文献方法[13]，研究对H2O2氧化损伤HaCaT细胞的保护作用。取处于对数生长期的HaCaT细胞，以每孔1.5×104个/mL的密度接种于96孔板中，培养24h后，将细胞分为对照组、模型组、给药组，每组3个复孔，对照组仅添加DMEM完全培养基，模型组仅添加含H2O2的DMEM完全培养基，给药组分别加入含有0.8mmol/LH2O2和不同浓度游离活性物和双白纳米乳的DMEM完全培养基（对应白藜芦醇的浓度为2、8和32μg/mL），继续孵育24h后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，继续培养2h，然后用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度，计算HaCaT细胞存活率。

2.53D黑素皮肤模型美白功效评价

参照文献方法[14，15]，准备6孔板，每孔加3.7mLM-TA培养液，将气液面培养第3天即模型接收当天的模型转移至标记好的6孔板中，每个试验分组需要6个模型，将所有放有模型的6孔板转移至CO2培养箱中培养。空白对照（BC）不进行UVB辐照；阴性对照（NC）、阳性对照（PC，曲酸500μg/mL）及1%双白纳米乳（含白藜芦醇200μg/mL）每天进行UVB辐照处理（50mJ/cm2）。阳性对照组和样品组在第3天，第5天分别进行两次给药，给药体积为10μL。模型连续培养7天后，收样待测。模型培养结束后，进行表观色度、表观亮度（L*）及黑素含量的检测。

2.6数据统计与分析

数据结果采用SPSS20.0软件进行统计学处理，所有数据均采用X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，使用ANOVA法评估两组结果差异，P<0.05被认为有统计学差异。

03结果与讨论

3.1粒径、PDI和Zeta电位

双白纳米乳为浅黄色透明澄清液体，检测其粒径为23.8±0.1nm，PDI为0.178±0.003，Zeta电位为-30.1±0.4mV，双白纳米乳中白梅花油和白藜芦醇的载负量分别为5.0%和2.0%。

3.2黑素细胞摄取行为

黑素细胞是美白作用的靶细胞，采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜研究B16F10细胞对纳米载体摄取行为，结果如图1和图2所示。

由图1可知，孵育2h和4h后，用FITC纳米乳处理组的细胞平均荧光强度分别为2938和6364，与游离FITC组相比，其平均荧光强度分别提高了40.98%和61.24%。实验结果表明纳米乳可以显著提升B16F10细胞对其包载物的细胞摄取和细胞内蓄积。

由图2可知，随着时间的延长，孵育4h时的细胞内荧光强度明显强于孵育2h时的荧光强度。孵育相同时间，FITC纳米乳细胞质中荧光强度明显强于游离FITC，而游离FITC主要聚集于B16F10细胞表面。结果表明，FITC纳米乳能够被快速摄取进入B16F10细胞。

3.3美白功效研究结果

3.3.1细胞酪氨酸酶活性的测定

相同白藜芦醇浓度的游离活性物组和双白纳米乳组对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响如图3所示。

由图3可知，与模型组相比，游离活性物中白藜芦醇浓度为8和32μg/mL时，双白纳米乳中白藜芦醇浓度为2、8和32μg/mL时，B16F10细胞酪氨酸酶活性显著降低（P<0.01）。与游离活性物组相比，双白纳米乳组能更显著抑制B16F10细胞酪氨酸酶活性（P<0.05或P<0.01）。

3.3.2细胞黑素含量的测定

游离活性物和双白纳米乳对B16F10细胞中黑色素合成量的影响如图4所示。

由图4可知，白藜芦醇浓度为2、8和32μg/mL时，与模型组相比，游离活性物和双白纳米乳能显著降低B16F10细胞黑素含量（P<0.01）。白藜芦醇浓度为8、32μg/mL时，与游离活性物相比，双白纳米乳能更显著地降低B16F10细胞中黑色素合成量（P<0.05或P<0.01）。

3.3.3细胞抗氧化作用的检测

游离活性物和双白纳米乳对氧化损伤的HaCaT细胞修复效果如图5所示。

由图5可知，模型组HaCaT细胞经0.8mmol/LH2O2损伤后细胞存活率下降至45.36%，细胞损伤效果明显，表明H2O2氧化损伤HaCaT细胞模型建立成功。与模型组相比，游离活性物和双白纳米乳均可显著提高氧化损伤细胞的活性（P<0.05或P<0.01）。白藜芦醇浓度为8、32μg/mL时，与游离活性物比较，双白纳米乳对氧化损伤细胞的活性提高更為显著（P<0.05或P<0.01）。

3.43D黑素皮肤模型检测结果

3.4.1表观色度比较

3D黑素皮肤模型给药结束后进行表观色度检测，正常组、对照组和双白纳米乳组对3D黑素皮肤模型表观色度的影响如图6所示。

由图6可知，与空白对照（BC）相比，阴性对照组（NC）经UVB刺激后，3D黑素皮肤模型表观色度明显变黑，表明UVB照射诱导了3D皮肤模型中黑色素的生成。与NC组相比，阳性对照（PC，曲酸）组模型表观色度明显变白，说明本次实验条件有效。与NC组相比，经双白纳米乳处理后，3D黑素皮肤模型的表观色度显著变白，且与PC组色度相当。

3.4.2表观亮度结果（L*值）

对表观色度检测结束后的模型进行L*值测定，不同组对3D黑素皮肤模型L*值的影响检测结果如图7所示。

由图7可知，与BC组相比，NC组经UVB刺激后，皮肤模型L*值显著降低（P<0.01），表明紫外线照射诱导皮肤模型变黑、变暗。与NC组相比，PC组L*值显著上升（P<0.01），说明本次实验条件有效。与NC组相比，经双白纳米乳处理后，3D黑素皮肤模型的L*值显著提升（P<0.01），且与PC组的L*值相当，表明双白纳米乳具有显著提升皮肤L*值，提亮肌肤的功效。

3.4.3黑色素含量结果

对表观色度检测结束后的模型进行黑色素含量测定，不同组对3D黑素皮肤模型黑色素含量的影响如图8所示。

由图8可知，与BC组相比，NC组经UVB刺激后，皮肤模型的黑色素含量显著上升（P<0.01），表明紫外线照射诱导了皮肤模型中黑色素的生成。与NC组相比，PC组黑素含量显著下降（P<0.01），说明本次实验条件有效。与NC组相比，双白纳米乳对3D黑素皮肤模型黑色素含量降低具有显著作用（P<0.01），且与PC组黑色素含量相当，表明双白纳米乳具有显著抑制黑色素合成的功效。

04结论

成功制备白梅花油、白藜芦醇等皮肤美白活性成分经皮共输送纳米载体—双白纳米乳，其平均粒径为23.8±0.1nm，PDI为0.178±0.003，Zeta电位为-30.1±0.4mV。黑素细胞摄取实验表明，双白纳米乳可显著提高B16F10细胞对活性成分的摄取，从而提高活性成分的生物利用度。细胞功效实验结果显示，双白纳米乳具有提高酪氨酸酶抑制率、减少黑色素生成及增强抗氧化的功效，且效果优于同剂量的游离活性物。3D黑素皮肤模型实验结果显示，双白纳米乳可明显改善黑素皮肤模型的表观色度，显著提升黑素皮肤模型的L*值及显著降低黑色素合成量，且效果与阳性对照组曲酸相当。研究结果表明，采用经皮共输送纳米载体技术构建的双白纳米乳可显著增强细胞及3D皮肤模型美白功效，双白纳米乳作为新型美白功效原料具有良好的应用前景。