宫艳超，赵 靖，崔 迎，吴国旭

（天津渤海职业技术学院环境与化工学院，天津 300402）

抗病毒药物是一类用于预防和治疗人和动物病毒感染的药物，目前较常用的抗病毒药物主要有核苷类（阿昔洛韦、奥司他韦、泛昔洛韦、吗啉胍）、非核糖苷类（阿比多、三环胺类美金刚、金刚烷胺）、非核苷类（奈韦拉平）以及异环胺类（咪喹莫德）等[1-2]。由于抗病毒药物对动物常见的病毒性流感疾病有一定的预防和治疗效果，且价格低廉[3-4]，常被用在畜牧养殖业中。但是在使用过程中用量控制不好或者滥用会使这些抗病毒药物在动物体内形成药物残留等问题，严重的还可能会使病毒菌株发生变异，危害人类健康[5-6]。目前抗病毒药物多组分的检测方法尚不完善，有必要建立一种方法快速检测这些组分，加强抗病毒药物在动物源性食品中的残留监控。

现如今对食品的安全性要求较高，市场上以动物源为基质的食品品种繁多，所占市场份额也越来越大。加之近些年食品中兽药残留事件频频曝光，所以人们对这类特殊食品中的药物残留越来越重视，而抗病毒药物的残留检测就是其中研究的热点[7-9]。目前食品中抗病毒药物残留的检测方法主要有酶联免疫法[10-12]、高效液相色谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15]等。由于大多数抗病毒药物属于强极性化合物，在常规反相色谱柱上保留性能不佳，强极性和高水溶性也给样品前处理和色谱分离增加了难度。采用溶剂萃取的前处理方式处理动物源性食品，目标物回收率不理想。酶联免疫法、高效液相色谱法较为常用，但由于仪器精度所限，检测的灵敏度不高；常用的高效液相色谱-串联质谱法虽灵敏度较色谱法有所提高，但检测时流动相中需加入离子对试剂，会存在系统稳定性差以及容易出现高离子强度抑制待测物电离等问题[16]。亲水交互作用色谱（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一种组分分离模式介于正相色谱和反相色谱之间的色谱技术，适用于分析强亲水性和强极性化合物，可解决样品中多种强极性组分分离难的问题[17-18]。国内将亲水交互作用色谱法应用于食品中抗病毒药物检测方面的研究较少，本研究通过式固相萃取净化技术，结合亲水色谱分离技术对强极性较难分离的9种抗病毒药物组分进行提取后，通过亲水交互作用色谱-串联质谱法（HILIC-tandem mass spectrometry，HILIC-MS/MS）检测动物源性食品中9种抗病毒药物组分的残留，克服了常规方法目标物难分离的缺陷，以期为此类药物残留的分析和监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奈韦拉平（98.5%）、泛昔洛韦（99.2%）、阿比多（99.0%）、阿昔洛韦（99.0%）、咪喹莫德（99.5%）、美金刚（99.0%）、金刚烷胺（98.5%）、奥司他韦（99.2%）、吗啉胍（98.5%） 标准品，上海安谱实验科学科技有限公司；乙酸铵、三氯乙酸、偏磷酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈 色谱纯，德国Merck公司；MCX、MAX以及PRiME HLB固相萃取小柱（规格均为100 mg/3 mL） 美国Waters公司；动物源性食品（牛肉干、猪肉脯、羊肉卷、鸡肉肠、火腿肠、酱卤肉、酱鸭翅、鸡蛋、牛奶）

购买于当地超市。

Waters Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪、ZIC-HILIC色谱柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm） 美国Waters公司；Inert Sustain Amide色谱柱（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）、TSKgel Amide-80色谱柱（3.0 mm×150 mm，2 μm） 日本岛津有限公司；Sielc ObeliscR色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美国Sielc科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱柱的选择 不同的亲水色谱柱类型对抗病毒药物组分分离效果不同，本研究参考相关文献[19-20]，选择4种色谱柱ZIC HILIC色谱柱（键合相为硅胶）、InertSustain Amide色谱柱（键合相为酰胺基）、TSKgel Amide-80色谱柱（键合相为酰胺基）以及Sielc Obelisc R色谱柱（键合相为含电荷的极性和非极性混合基团），比较分离9种抗病毒药物组分的效果。

1.2.2 仪器条件 质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI+源）；多反应监测模式；离子源温度为200 ℃；脱溶剂气流量为20 L/min；锥孔气流量为2.0 L/min。

色谱条件：Sielc Obelisc R色谱柱，流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2.0 μL；流动相中A：10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），B：乙腈，梯度洗脱步骤如表1所示。

表 1 流动相梯度洗脱步骤Table 1 Mobile phase gradient elution step

1.2.3 样品前处理 称取2.0 g样品至50 mL离心管中，加入20 mL提取液（20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液、20 g/L三氯乙酸溶液，20 g/L偏磷酸-甲醇溶液，1%乙酸-乙腈溶液），使用2000 W功率超声仪常温下超声10 min后离心2 min （5000 r/min），取10 mL上清液进固相小柱（MCX、MAX以及PRiME HLB）进行净化，固相萃取过程按照上样、淋洗、洗脱等步骤进行后，收集滤液过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.2.4 标准曲线的绘制 称取适量的9种抗病毒药物标准品，用甲醇超声溶解并配制成1000.0 ng/mL的中间储备液，检测前以流动相配制成0.1～50.0 ng/mL浓度范围的标准混合溶液，经仪器进行分析，绘制标准曲线。

1.2.5 样品检测及方法的适用性 对10份不同品牌动物源性食品中9种抗病毒药物组分残留分别用现行标准方法（SN/T 4253-2015 出口动物组织中抗病毒类药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法）和本研究方法进行测定，并比较结果，分析方法的适用性。

1.3 数据处理

本试验数据均重复5次，并利用SPSS 19.0进行方差分析，采用Origin 8.5和TBtools软件作图。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

结果如图1所示，比较ZIC HILIC柱、TSKgel Amide-80柱、InertSustain Amide柱以及Sielc Obelisc R柱4款亲水作用色谱柱发现，ZIC HILIC柱分离9种抗病毒药物组分的效果不理想，目标组分出峰重叠，分离度较差（图1a）；而TSKgel Amide-80柱在乙腈-1%甲酸为流动相等度洗脱模式下，可以实现部分抗病毒药物组分的分离（图1b）；在InertSustain Amide柱色谱柱上对9种组分的保留效果不好，在前2 min内有6种待测组分基本分离出峰，而阿比多、阿昔洛韦、吗啉胍由于其极性较大，在此色谱柱上没有保留，整体分离效果也较差（图1c）；而Sielc Obelisc R色谱柱由于含电荷的极性和非极性混合基团，所以对9种组分的分离效果较好，出峰时间适宜，各组分也有较好的分离度（图1d），不同键合固定相的色谱柱在分离目标物组分的过程中保留机制迥异，故本研究最终采用Sielc Obelisc R色谱柱。

图 1 4种色谱柱的分离效果比较Fig.1 Comparison of purification of 4 kinds of chromatographic columns

2.2 质谱参数的选择

本研究检测的9种抗病毒药物组分结构中均含有胺基基团，在离子化过程中易与H离子结合后带有正电荷，所以在分析时采用正离子扫描模式对9种组分的混标溶液进行母离子和子离子的质谱扫描，并优化质谱参数，具体质谱分析参数见表2。

表 2 9种组分的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of nine components

2.3 流动相条件的优化

在流动相的选择上比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）、乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）和乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）等不同流动相在Sielc Obelisc R亲水色谱柱的分离效果。结果发现，流动相中含有一定比例的乙酸铵会维持流动相pH的稳定性，能改善峰形，减少拖尾，洗脱效果最好；并在乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相的基础上比较发现，流动相中没有甲酸存在的情况，9种抗病毒药物组分的电离效果不理想，出现峰型不对称性等情况，将流动相中的水更换为甲酸溶液后，流动相体系为酸性，待测组分电离更充分，分离情况得到改善。故又比较了流动相中甲酸溶液浓度分别为0.05%、0.1%和0.2%的情况下，各组分的检测响应值。通过测定各组分的响应值发现，含0.1%甲酸流动相组成，各组分的响应值最高，因此本研究以乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相，通过适度的梯度洗脱步骤，可以保证各个化合物有良好的峰形、分离度及响应强度，在Sielc Obelisc R亲水色谱柱上分离9种抗病毒药物组分的总离子流（total ion chromatography,TIC）图见图2。

图 2 9种抗病毒药物组分的TIC图Fig.2 TIC diagrams of 9 kinds of antiviral drug components

2.4 提取溶剂的选择

考虑到肉制品、奶制品、蛋制品等动物源性样品中有大量蛋白和磷脂类物质，实验所用提取液最好既能沉淀蛋白，又能降低基质效应。参考相关文献[21-22]，本研究分别比较：提取溶液Ⅰ：20 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，提取溶液Ⅱ：20 g/L三氯乙酸溶液（9:1，V/V），提取溶液Ⅲ：20 g/L偏磷酸-甲醇溶液（8:2，V/V），提取溶液Ⅳ：1%乙酸-乙腈溶液，分别添加了50 μg/kg的阳性样品中的目标组分，比较各目标组分峰面积，分析不同类型的提取溶液对9种组分提取的影响。

由图3可知，1%乙酸-乙腈的提取效果整体优于其他3种提取溶液，能够有效提取9种组分，且不同提取溶液间提取效果差异显著（P＜0.05）。这可能是由于在提取液偏酸性的环境中，目标组分在提取液中的分配系数较高，实现较满意的提取效果[23]。结合上述流动相中乙腈作为样液溶剂，为了减少溶剂转化步骤，因此选择1%乙酸-乙腈作为该方法的提取液。

图 3 不同提取溶液对峰面积的影响Fig.3 Effects of different extraction solutions on peak area

2.5 固相萃取柱的选择

动物源性食品提取液中杂质组分易对目标组分产生干扰[24]，本研究采用固相萃取法进行净化提取液，比较了HLB、MCX、MAX共3款小柱对提取液的净化效果，以各组分加标回收的峰面积为比较依据，结果如图4所示。

图 4 不同固相小柱对峰面积的影响Fig.4 Effect of different solid phase columns on peak area

由图4可知，综合比较来看HLB固相小柱的净化效果最好，各组分的峰面积最高，与其他两款固相小柱的效果大部分差异显著（P＜0.05）。这是因为HLB固相小柱适用范围广，特异性不强，适合大多数化合物，而MCX和MAX固相小柱特异性强，对部分待测组分的保留性较差，所以使用HLB小柱回收效果较好[25]。且本研究采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，样品提取液采用通过式净化方式，省去了活化和洗脱步骤，缩短实验时间，提高了效率，故选择PRiME HLB固相小柱。

2.6 方法的线性范围与灵敏度

将9种抗病毒药物组分的标准混合溶液以乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，绘制标准曲线。结果如表3所示，9种组分在线性范围内均具有较好的线性关系，依据色谱峰的信噪比（S/N）3倍确定检出限（LOD），信噪比（S/N）的10倍确定定量限（LOQ），得到目标组分的LOD范围为0.1～0.5 μg/kg，LOQ范围为0.3～1.5 μg/kg，方法灵敏度高。

表 3 9种组分的回归方程和决定系数Table 3 Regression equation and determination coefficients of nine kinds components

2.7 方法回收率与精密度

本研究加标回收样品分别添加相对于9种抗病毒药物组分定量限的低、中、高的三个水平混合标准品，每个结果测定5次，进行加标回收试验（表4）。

表 4 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of the method (n=5)

由表4可见，9种抗病毒药物组分的加标回收率为82.3%～95.7%，RSD为3.2%～5.9%，说明本试验检测数据的准确度和精密度可靠。

2.8 实际样品检测及方法的适用性

在上述优化试验条件下，对10份不同品牌动物源性食品中9种抗病毒药物组分残留进行了分析。检测结果发现，9种目标物组分含量均未检出，结果良好，符合国家标准要求。为验证方法的适用性和可靠性，对阴性样品进行加标处理后（加标2.0、10.0、50.0 μg/kg），分别用标准方法（SN/T 4253-2015）和本研究的方法进行测定，并比较结果，结果如表5所示。从表5的结果可以看出，本研究的方法所测定的结果与标准方法所能测定的组分结果在合理的误差范围内，表明本方法适用于动物源性食品中9种抗病毒药物组分残留的测定。

3 结论

本文通过4种HILIC机理色谱柱的比较、流动相的选择以及样品前处理条件的优化，建立了一种亲水作用色谱-串联质谱法检测动物源性食品中9种抗病毒残留的分析方法。样品由1%乙酸-乙腈溶液进行提取，并经PRiME HLB固相小柱净化处理后，可实现对9种待测组分的有效检测。本方法有效解决了抗病毒组分在反相色谱柱上保留效果不佳、加标回收率低的检测难点，与目前的国家标准和标准方法相比，在保证准确性好、灵敏度高的同时，尽可能省去了复杂的前处理，降低了检测成本，提高了检测目标种类和效率，可为动物源性食品中9种抗病毒药物残留的分析和监控提供技术支持。