高 玲 封东进 王光猛 董中茂 周 琦 孙蓓蓓

徐州医科大学附属徐州儿童医院消化内科 (江苏 徐州， 221000)

婴儿胆汁淤积性肝病是一种因各类原因导致胆汁释放及排泄障碍而引起胆汁酸代谢异常，并造成器质性损伤的肝胆系统疾病，患儿主要表现为皮肤瘙痒、乏力、黄疸等，部分可见肝肿大、营养不良等[1]。代谢性疾病的发病机制极为复杂，目前临床针对婴儿胆汁淤积性肝病的发生与发展，国外诸多研究显示，可能与肠道微生态紊乱有关[2]。其中肠道菌群-胆汁酸代谢通路对疾病的作用至关重要，血清总胆汁酸(TBA)作为一种信号分子，可在肠道菌群的影响下加速病情发展[3]。国内有关肠道微生态成分的变化与胆汁酸代谢及婴儿胆汁淤积性肝病的相关性研究较为鲜少，本研究旨在通过探究肠道微生态与胆汁酸代谢、婴儿胆汁淤积性肝病的关系，为临床诊治及预防提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年5月至2019年5月于我院就诊的51例婴儿胆汁淤积性肝病患儿为观察组，并随机选取同期57例健康婴儿作为健康对照组。本次研究得到医学伦理委员会批准。

1.2 纳入标准 ①符合美国与欧洲儿科学会联合制订的胆汁淤积性肝病诊断标准者[4]；②月龄1～3月者；③直接胆红素(DBil)>17 μmol/L者；④主要监护人知情同意，主动提出签署知情同意书者。

1.3 排除标准 ①影像学未排除胆管结石、胆总管囊肿、胆管癌等肝外胆道梗阻性疾病者；②合并呼吸、消化、泌尿等系统性疾病者；③入组前1个月曾服用抗生素、益生菌等影响肠道菌群生物稳态的药物治疗者；④合并先天性疾病者；⑤近期存在急性或慢性感染史者。

1.4 研究方法

1.4.1 临床资料收集 收集两组研究对象资料，参考《胆汁淤积性肝病诊断和治疗共识(2015)》[5]中的规范化治疗方案给予所有患儿基础治疗及个体化治疗，包括熊去氧胆酸、激素、免疫抑制剂等。一般资料包括姓名、性别、病程、病因等，检测其生化指标，包括总胆红素(TBil)、DBil、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、血氨、总胆固醇(TC)。

1.4.2 肠道微生态检测方法 收集其新鲜粪便标本200 mg，采用无菌离心管收集，并置于-80℃的冰箱内保存。仪器采用DP328粪便基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，通过特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的抑制剂吸附片InhibitEX配合专项开发的缓冲液系统提取粪便样本的基因组DNA。将冻干粉型的双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌菌株接种于液体培养基中培养24 h，同样抽取1 ml培养液后提取标准菌株DNA。采用光密度测定法检测260、280 nm处样本的吸光度，分析样本纯度及浓度，当A260/A280为1.8～2.2时符合标准。通过SYBR Green ReGPTime PCR Master Mix(上海芃硕生物科技有限公司，1 ml×5)检测患儿肠道菌群构成，引物设计参考细菌16S人DNA基因序列，其引物基因序列见表1。引物0.5 μl，模板DNA 1.0 μl，反应体积20 μl，95℃ 10 min,95℃ 20 s、59℃ 30 s、68℃ 30 s，40个循环，做标准曲线并换算标准品1 L的拷贝数。

表1 基因引物序列

1.4.3 胆汁酸代谢指标检测方法 于清晨空腹下行常规静脉采血5 ml置于抗凝管，4 h内测完血清TBA水平，采用酶比色法测定，试剂盒来自烟台澳斯邦生物工程有限公司，操作均严格按照试剂盒自带说明书进行。

1.5 观察指标 比较两组研究对象肠道微生态指标及血清总胆汁酸(TBA)水平，通过Pearson积矩相关分析评估婴儿胆汁淤积性肝病患儿的B/E值与TBA指标间相关性。观察组患儿根据是否发生肝硬化分为肝硬化组和无肝硬化组，比较组间肠道微生态指标，采用Spearman相关分析婴儿胆汁淤积性肝病患儿病情严重程度与肠道微生态指标相关性。

2 结果

2.1 一般资料情况 两组研究对象性别、年龄比较无统计学意义(P>0.05)，观察组患儿TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT、血氨、TC明显高于健康对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组对象一般资料比较

2.2 肠道微生态指标情况 观察组患儿DNA-A260、双歧杆菌、乳酸杆菌数量及B/E值明显低于健康对照组(P<0.05)，而大肠杆菌数量明显高于健康对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组对象肠道微生态指标情况比较

2.3 胆汁酸代谢指标情况比较 观察组患儿TBA水平为(56.23±7.12)μmol/L明显高于健康对照组(4.13±1.07)μmol/L，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2.4 Pearson相关性分析 婴儿胆汁淤积性肝病患儿B/E值与TBA水平具有负相关(r=-0.838，P<0.05)。见图1。

图1 胆汁淤积性肝病婴儿患儿B/E值与TBA水平的散点图

2.5 不同病情组间肠道微生态指标情况比较 观察组患儿根据是否发生肝硬化分为肝硬化组和无肝硬化组，肝硬化组双歧杆菌数量及B/E明显低于无肝硬化组(P<0.05)。见表4。

表4 不同病情严重程度组间肠道微生态指标情况比较

2.6 Spearman相关性分析 婴儿胆汁淤积性肝病患儿病情严重程度与DNA-A260、乳酸杆菌、大肠杆菌数量均无相关性(P>0.05)，与双歧杆菌数量及B/E值具有负相关性(P<0.05)。见表5。

表5 胆汁淤积性肝病患儿病情严重程度与肠道微生态指标的相关性分析 (r/P)

3 讨论

婴儿胆汁淤积性肝病主要病理变化为胆汁生成及排泄失衡，可导致胆管内压急剧升高，达到临界值后导致连接毛细胆管及胆管的Hering壶腹破裂，胆汁逆流进入血液[6]。该病的主要病因包括遗传、免疫、感染、结石等，可分为肝细胞性、胆管性及混合性胆汁淤积[7]。从疾病的发生发展过程角度分析，婴儿胆汁淤积性肝病可通过损害从胆管上皮细胞至肝细胞，或“自上而下”，从肝细胞损伤至胆管细胞两种病理模式发病，但具体发病机制尚有待深入阐明[8]。近十余年，国内外针对成人胆汁淤积性肝病的发病从多个方面有了更多的认识，包括肝纤维化机制、治疗靶点、肠道微生态等，其中肠肝循环和肠道微生态是现临床广泛关注的热点话题[9]。

肠道微生态是指栖息于人体肠道内的菌群平衡，正常生理状态下具有统一、稳定的特性，与宿主细胞共同维持生理功能[10]。人体肠道内的菌群主要包括共生性细菌、致病性细菌及条件致病菌，其中共生性细菌又包括双歧杆菌、乳酸杆菌，而致病性细菌包括大肠杆菌、沙门菌等，条件致病菌包括肠杆菌等[11]。一般情况下，少量的细菌或代谢产生进入肝脏可被自身免疫系统消除，但考虑病理状态下库普弗细胞及自身免疫系统功能减弱，导致肠道微生态失衡[12]。致病菌大量释放并产生一系列有毒代谢物质，通过“肝-肠”轴损害肝脏，并导致免疫系统过度激活，引发炎症反应，进一步加重组织损伤[13]。婴儿胆汁淤积性肝病患儿胆汁淤积后进入肠道的胆汁酸相对减少，无法有效调节肠道菌群数量，导致其微生态改变[14]。有关肠道微生态与肝胆疾病的研究，更多的报道关注肿瘤或炎性肠炎等疾病，郭磊等[15]发现，在结肠直肠癌的发生发展过程中，TBA及次胆汁酸水平均显著升高，且组织学显示癌组织处的肠道菌群微生态较癌旁组织处明显改变。

本研究结果显示，观察组患儿TBil、DBil、ALT、AST、ALP、GGT、血氨、TC、TBA水平明显高于健康对照组，表明婴儿胆汁淤积性肝病发病可引起肝功能、血脂代谢、胆汁酸代谢等异常。而分析其肠道微生态，结果显示，观察组患儿DNA-A260、双歧杆菌、乳酸杆菌数量及B/E值明显更低，而大肠杆菌数量明显更高，与徐志超等[16]探究婴儿胆汁淤积性肝病与肠道微生态的关系研究结果一致。经Pearson相关分析，婴儿胆汁淤积性肝病患儿B/E值与TBA水平具有显著负相关性，提示双歧杆菌为肠道保护菌群，而大肠杆菌可通过影响TBA水平参与婴儿胆汁淤积性肝病的发生。将所有婴儿胆汁淤积性肝病患儿根据有无肝硬化分为不同亚组，结果显示，随病情加重，其微生态紊乱亦随之加剧，且经Spearman相关分析，与双歧杆菌数量及B/E值具有负相关性。分析原因，婴儿胆汁淤积性肝病患儿胆汁淤积后可造成肝功能受损，其一机械屏障损伤，表现为肠道黏膜受损，难以阻挡细菌入侵；其二化学屏障损伤，指的是胆汁作为肠道菌群的主要调节物质，不仅可有效抑制致病菌生长，且还可直接与细菌产物及内毒素等结合，进而调节其稳态平衡，婴儿胆汁淤积性肝病患儿肠道内致病菌明显增多，优势菌数量显著下降，而肝内大量的TBA则破坏固有免疫系统，加重肝功能损伤；其三为免疫屏障损伤，表现为肝内免疫系统紊乱，炎性因子大量释放，并造成黏膜屏障损坏，细菌与内毒素释放入血；其四为生物屏障损伤，是指胆汁淤积后可造成肠粘膜功能受损，而引起细菌稳态失衡，而肠道菌群紊乱又可进一步通过炎症反应、内毒素移位、破坏肠道屏障等加重胆汁淤积。

婴儿胆汁淤积性肝病患儿肠道菌群分布及TBA水平与健康人相比存在显著差异，提示疾病的发生可能与菌群结构改变及TBA水平异常有关，但考虑样本纳入时间跨度较大，且由于地区限制，仅对本院的部分患儿进行研究，具有一定局限，有待后续改善后深入探讨。