蒋 瑶 邢 艳 （川北医学院附属医院检验科，南充 637000）

中性粒细胞是人体内含量最多的固有免疫细胞，通过抵御病原体入侵而在固有免疫中起重要作用，经典杀菌方式包括吞噬和脱颗粒。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）作为中性粒细胞区别于凋亡和坏死的第三种死亡形式，其独特的网状结构可捕获和杀灭病原体而对机体有保护作用。但近年越来越多研究发现，异常NETs 参与多种疾病发生发展，如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、癌症等［1］。阐明NETs 形成的分子机制对调控异常NETs 释放具有重要意义，进而为疾病治疗提供可能靶点。因此，本综述将重点论述NETs形成的分子机制，同时关注其与疾病发生发展的关系。

1 NETs概述

1.1 NETs 的发现及其结构特征 1996 年，TAKEI等［2］发现佛波酯（phorbol ester，PMA）处理中性粒细胞后的形态变化与凋亡和坏死完全不同，且最终可导致细胞死亡。8 年后，BRINKMANN 等［3］发现激活后的中性粒细胞释放颗粒蛋白和染色质后形成NETs从而诱捕细菌。2007年，FUCHS等［4］证实中性粒细胞释放NETs 的这种死亡方式不同于凋亡和坏死，并将其定义为中性粒细胞胞外诱捕网式死亡（NETosis），其大致过程为中性粒细胞被活化后，核膜裂解，胞质中的弹性蛋白酶和髓过氧化物酶进入细胞核内并作用于组蛋白，促使染色质解聚，从细胞核中释放出来与细胞质中的各种抗菌物质及颗粒蛋白结合后一起释放至胞外形成NETs［5-6］。高分辨率扫描电子显微镜显示，NETs具有独特的超微结构，其主要成分为直径15～17 nm 的DNA 纤维和直径约为25 nm 的球形蛋白结构域，共同构成可达50 nm的三维网状结构［3］。

1.2 NETs 的启动因素 NETs 是中性粒细胞激活后释放的网状结构，活化因素包括多种病原体，如肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、利士曼原虫、HIV-1等［6］。一些细胞因子、化学试剂和细菌成分也可促进NETs 生成，如TNF-α、PMA、脂多糖（lipopolysac⁃charide，LPS）［7］。研究发现脂类物质也可调控NETs形成，如中性粒细胞脂质成分改变可促进NETs 形成［8］；生理水平的2-氯脂肪酸可诱导人中性粒细胞形成网状结构，且可减少大肠杆菌集落形成［9］；氧化性低密度脂蛋白可显著促进PMA 诱导的HL-60 来源的中性粒细胞形成NETs，而还原性低密度脂蛋白则无此功能［10］。经典化学诱导剂PMA 或金黄色葡萄球菌存在情况下，抗菌肽LL-37 可显著促进人源性原代中性粒细胞网状结构形成［11］。ARAI 等［12］发现低浓度尿酸可抑制NETs 形成，而高浓度则促使NETs 产生。血红素可在体内外刺激中性粒细胞释放NETs，而参与镰状细胞病发病过程［13］。抗磷脂抗体和抗中性粒细胞胞浆抗体可刺激NETs 形成而分别参与抗磷脂综合征患者血栓产生及抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎发病过程［14］。更多通过刺激NETs 形成而参与疾病进展的诱导物有待进一步发现。

2 NETs形成的分子机制

2.1 活性氧（reactive oxygen species，ROS） ROS是一组有高化学活性的含氧分子总称，包括次氯酸、过氧化物、单线态氧等，几乎可与所有细胞成分作用而改变其特性。机体生理产生的ROS 则主要由酶代谢产生，如NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）复合物。研究表明，胞内NOX 参与NETs 形成，加入NOX 抑制剂（二亚苯基碘、DPI）时可抑制氧化 还 原 反 应 完 全 阻 断PMA 诱 导 的NETs 释 放［15］。NOX 缺陷突变小鼠中性粒细胞无法形成NETs，且慢性肉芽肿性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）患者中性粒细胞因缺少NOX 膜亚基gp91phox（即NOX2），采用PMA 刺激后无NETs 产生，加入外源性过氧化氢时则恢复其NETs 形成能力，且通过基因治疗重塑CGD 患者中性粒细胞生成NETs 能力后可恢复其对曲霉菌分生孢子和菌丝的清除，并促使难治性侵袭性肺曲霉菌病快速治愈［16］。IL-8通过PI3K/AKT/ROS轴促进NETs形成而参与胶质母细胞瘤进展［17］；载脂蛋白E 可通过ROS/MAPK/MSK1 途径调控NETs 形成而促进心肌梗死后梗死愈合［18］。证明NOX 产生的ROS 对NETs 形成具有重要作用，有助于开发相应治疗药物，如中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂ONO-5046 可通过抑制ROS 产生而减少LPS 诱导的NETs 形成，从而减轻炎症症状［19］。此外，几种调节NOX2 活性的酶，如蛋白激酶C，也参与网状形成，但触发NETs 释放的受体和ROS 驱动的分子机制鲜有报道［20］。

NETs形成除依赖ROS经典途径外，也存在不依赖ROS的早期/快速释放途径。NOX 非依赖性NETs形成过程中，中性粒细胞无法被裂解，而通过核膜起泡和由内向外的囊泡运输释放NETs。活化的血小板是NOX 非依赖性网络形成的有力诱导物［21］。此外，白色念珠菌刺激中性粒细胞通过Dectin-2 介导的NOX 非依赖性NETs 形成有助于抑制真菌扩散［22］。TNF-α、利什曼原虫前鞭毛体、免疫复合物（immobilized immune complexes，ICs）诱导形成的NETs 均不依赖于ROS 途径［5，15，23］。综上，NETs 形成是否需ROS 参与因刺激物种类而异，而ROS 通过何种机制促进NETs形成有待进一步研究。

2.2 肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptiylarginine deimidase 4，PAD4） PAD 是一种翻译后修饰酶，可催化蛋白肽链中精氨酸残基转变为瓜氨酸残基。PAD有5个亚型，其中PAD4通过介导组蛋白精氨酸残基瓜氨酸化使染色质去致密化参与NETs 形成过程，而PAD2 参与TNF-α 诱导的组蛋白瓜氨酸化而参与关节炎发病，与NETs形成无关［24］。GÖßWEIN等［25］发现钙离子载体诱导的NETs 形成显著依赖于PAD4，选择性PAD4 抑制剂可阻止其诱导的染色质解聚，并进一步发现PAD4 依赖于钙蛋白酶蛋白水解发挥其破裂核膜和解缩染色质能力。且氯胺啶（一种广谱的PAD 抑制剂）或GSK484（一种选择性的PAD4 抑制剂）也可阻止TNF-α、GM-CSF、PMA 诱导的组蛋白H3 瓜氨酸化［15］。趋化因子刺激PAD4-/-中性粒细胞后无法形成NETs 而丧失固有免疫防御能力［26］。PAD4 缺陷中性粒细胞在离子霉素或PMA体外刺激下无法释放NETs，但因产生更多ROS而加重急性炎症，增加心肌梗死后组织损伤［27］。此外，PAD4-/-乳腺癌小鼠因NETs 形成障碍可减小原发性肿瘤及肺转移瘤体积和重量，且靶向抑制PAD4 表达可明显改善克罗恩病、多发性骨髓瘤、急性胰腺炎、狼疮模型小鼠临床症状及疾病进展［28-32］。综上，PAD4 通过参与NETs 形成而介导相应疾病，那么调控PAD4 功能的相关分子又有哪些？研究表明由TNFAIP3编码的A20去泛素酶结构域遗传变异通过上调PAD4 表达及由此产生的蛋白瓜氨酸化和NETs 形成增加SLE 易感性［33］。此外，miR-155 通过富含AU 元件的3'UTR 区而调控PAD4 mRNA 表达，因此，靶向miR-155 可能有助于抑制炎症性疾病中过度NETs 生成［34］。但当白色念珠菌、溶组织内阿米巴滋养体作为刺激物时，NETs形成也可不依赖于PAD4 活性［35-36］。故PAD4 在NETs 形成中的作用有待进一步研究，且这些刺激因子在中性粒细胞中如何活化PAD4而促进NETs形成的机制尚不明确。

2.3 信号通路蛋白 细胞生长、增殖、衰老等生物学过程受大量信号蛋白分子调控，从而影响整个机体生命进程。NETs作为中性粒细胞的一种死亡形式，参与其中的信号通路蛋白是研究热点。ZHU 等［37］研究发现PMA、离子霉素和MSU 刺激中性粒细胞后分别有64、97 和141 种蛋白受不同调控，进一步发现有931、565 和201 个磷酸化位点存在差异调节。据此发现抑制TAK1、p38 MAPK 及MEK通路后中性粒细胞形成的胞外染色质细丝较短，且几乎无相互连接，但对染色质的释放影响较小，从而调控NETs早期形成。相比之下，Syk 和PI3K 蛋白抑制剂处理中性粒细胞后几乎无染色质排出，表明其参与NETs后期形成过程。而抑制PKC、Src家族激酶和JNK 合成及转录和蛋白翻译过程后无法有效阻止NETs 产生［15］。但特异性抑制剂实验证明JNK 和PI3K 参与绿脓素诱导的NETs 形成［7］。RAVINDRAN 等［38］研究发现，JNK 抑制剂如SP600125 显著干扰LPS 诱导的NETs 形成，但不影响PMA 的刺激作用，表明两种激动剂通过不同机制发挥其作用。此外，不同生理性刺激剂参与NETs 生成的分子机制也有差异，如抗β2-糖蛋白Ⅰ（β2GPⅠ）/β2GPⅠ复合物刺激形成的NETs 不依赖于p38、AKT、ERK1/2 或锌信号［39］。固定化ICs 诱导人原代中性粒细胞释放的NETs，由FcγRⅢb 介导，β2 整合素及Src/Syk、PI3K/Akt、p38 MAPK 和ERK1/2 参与通路调控［40］；此外，丙泊酚可通过抑制p-ERK 和HOCl 产生减少PMA 诱导的NETs 形成［41］。假结核耶尔森氏菌黏附蛋白invasin可诱导ROS 产生和染色质释放进入胞外环境，通过β1 整合素介导，依赖于ROS 和PI3K 信号传递［42］。总之，多种级联蛋白通路参与NETs 形成，但又因刺激物不同而存在差异。

近年研究发现，多条信号通路蛋白通过调控NETs 形成而参与多种疾病发生发展。NETs 驱动银屑病的皮肤炎症反应及急性肺损伤中分别依赖于TLR4/IL-36R、MyD88/NF-κB及p38 MAPK通路激活，RA患者中，IgA自身抗体复合物可通过激活FcαRⅠ诱导NETs形成引起关节损伤，加重疾病［43-45］。此外，研究发现靶向阻断NOX2 和p38 MAPK 信号可改善NETs引起的慢性肝病患者术后肝功能和生存率抑制STAT1、HMGB1-TLR2/TLR4、PI3K-γ、Raf1-MEK-1-Erk 激活可减轻NETs 引起脑缺血损伤、急性炎症损伤及显微镜下型多血管炎等多种疾病的临床症状［46-50］。综上，靶向抑制信号通路蛋白活化可在一定程度治疗NETs相关性疾病。

2.4 自噬 自噬在中性粒细胞中高度保守，不仅骨髓中参与中性粒细胞分化，且在中性粒细胞颗粒形成、脱颗粒、细胞因子产生、NETs释放等方面发挥重要作用［39］。ANCA 诱导的自噬可促进NETs 形成，这种作用可被自噬诱导剂雷帕霉素增强，被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）减弱［51］。ULLAH 等［52］发现肺炎球菌以Ⅲ型PI3K 依赖的方式诱导中性粒细胞自噬。抗溶酶体膜蛋白-2 抗体（抗LAMP-2 抗体）刺激的人中性粒细胞凋亡率显著降低，这种作用可被自噬抑制剂3-MA 和LY294002 减弱，而凋亡抑制剂ZVAD-fmk 和坏死抑制剂NEC-1 则无明显影响。此外，抗LAMP-2抗体刺激的中性粒细胞中，LC3BⅠ转化为LC3BⅡ的比例显著提高，并出现大量空泡化，呈现典型自噬特征，证明自噬参与人中性粒细胞网状结构形成［53］。自噬基因ATG5 缺陷小鼠的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞在生理激活或暴露于低浓度PMA 时均无网状结构形成［54］。研究发现，NETs依赖于自噬而参与胰腺癌发病过程，且应激反应蛋白REDD1通过调节自噬促进NETs形成而参与SLE 终末器官损伤和纤维化［55-56］。故通过抑制自噬可能对NETs相关性疾病起一定防治作用。

2.5 代谢相关分子 除调控NETs 形成的蛋白外，NETs 形成的代谢特征也引发广泛关注。PMA 刺激形成NETs 时葡萄糖摄取和糖酵解速率增加，糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖抑制NETs 形成，说明NETs形成依赖于葡萄糖。中性粒细胞在无糖培养基中暴露于PMA 3 h时，失去其特有细胞核形态，但不释放NETs，加入葡萄糖后，几分钟内就会发生净释放，表明NETs 形成在代谢上分为两个阶段：第一阶段独立于外源葡萄糖（染色质解聚），第二阶段严格依赖于外源葡萄糖和糖酵解，且葡萄糖通过磷酸戊糖途径参与NETs 形成［57］。ZHU 等［37］研究显示磷酸化细胞色素b-245 轻链（p22phox）在PMA 和离子霉素处理的中性粒细胞中分别上调11.7 倍和3.9 倍。此外，磷酸化中性粒细胞胞浆因子4（p40phox）在PMA 处理的中性粒细胞表达比未经处理的对照细胞高6 倍。病原体被特异性受体识别后，通过细胞内Ca2+浓度升高而启动NETosis，因此，Ca2+离子载体A23187 被认为是NETs 的半生理学模型，透射电镜观察A23187 处理的中性粒细胞，线粒体基质肿胀，线粒体通透性转换孔开放，进一步发现其诱导的NETs 由线粒体产生的ROS 介导［6］。AWASTHI 等［58］采用PMA和A23187分别作为NOX依赖和非依赖性NETs诱导剂，评估NETs形成的代谢需求，发现两种诱导剂均导致细胞外酸化率、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性增加，丙酮酸激酶M2 因二聚化而活性降低，通过Warburg 效应促进乳酸形成。有趣的是，外源性乳酸处理也诱导了人中性粒细胞NETs 形成，而LDH 活性的抑制显著减少了这两种途径的NETosis，证明了乳酸和糖酵解在NETs形成中的作用以及揭示了NOX 依赖和非依赖NETs形成的共同代谢途径。但随后的研究观察到的分子和动态差异证实其是生物学上不同过程的结果，LPS 和PMA 可诱导细胞早期Ca2+聚集，而使细胞内钙浓度升高，直至质膜破裂［22］，但A23187 是由钙激活的小电导钾通道成员SK3 和线粒体ROS 介导的［59］。此 外，ATP 通 道pannexin1（Panx1）参 与 了A23187 及PMA 体外诱导的NETs 形成，且Panx1-/-小鼠分离的中性粒细胞表现出减少或延迟诱导的NETs产生［60］。

3 结语

自发现NETs 参与多种疾病的发生以来，诸多学者致力于研究其形成的分子机制，发现ROS、PAD4以及一些蛋白通路和代谢分子均调控了NETs形成，进而推动了与NETs 相关疾病的分子靶点药物的研究。尽管近年来关于NETs 形成方面的研究取得了进展，但参与NETs 形成的关键物质及其在患者体内如何发挥作用尚未完全阐明。故对NETs的深入研究才能使人们更好地了解NETs 相关疾病进而在防治方面取得突破。尽管一些有希望的治疗药物正在研究中，但NETs 在宿主防御中过程起关键作用，故任何针对其形成的治疗均需考虑避免损伤其生理功能。