单 萍 张继龙 笱玉兰 罗利俊

(湖北省武汉市第一医院神经内科，武汉，430022)

癫痫是一种全球范围内常见的慢性神经系统疾病[1]，它影响了世界所有地区的各个年龄阶段的人类健康。任何引起大脑生理结构或功能紊乱的因素都能导致癫痫，且可发生于人的任何阶段[2]。癫痫以自发性发作为特征[3]，其发作是一种涉及部分或整个身体的短暂不自觉颤抖，有时伴有意识丧失，且癫痫发作的强度和频率都有差异[4]。研究发现，目前抗癫痫药物已无法控制20%～30%具有药物抵抗性的难治性癫痫发病[5]。因此，寻找具有较好疗效且不良反应少的抗癫痫药尤为重要，而中医学可成为抗癫痫药物的替代品[4]。据相关报道，星形胶质细胞可通过控制细胞外空间体积以及离子和神经递质稳态来调节突触的活动，当其出现功能障碍时，可导致神经功能发生重大改变，从而参与了癫痫的发病机制[6-7]。柴胡龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》，具有较好的抗癫痫作用，且与柴胡龙骨牡蛎汤的剂量正相关[8-9]。课题组前期研究结果显示：柴胡加龙骨牡蛎汤对戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)点燃癫痫小鼠的大脑神经元具有保护作用[10]，但柴胡龙骨牡蛎汤治疗癫痫的具体作用机制并未阐明。因此，本研究将使用PTZ刺激小鼠海马星形胶质细胞，用不同剂量的柴胡龙骨牡蛎汤处理后，检测细胞内相关炎症介质的表达情况，初步探讨柴胡龙骨牡蛎汤治疗癫痫的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取60只孕20 d的清洁级小鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018，动物实验伦理审批号：HLK-20181118-02。饲养温度为22～26 ℃，相对湿度为50%～60%，人工光照明暗各12 h，自由饮水、饮食。

1.1.2 药物 柴胡龙骨牡蛎汤(柴胡12 g，龙骨、黄芩、生姜、铅丹、人参、桂枝、茯苓、牡蛎各4.5 g，半夏、大黄各6 g，大枣6枚)由我院中药制剂中心釆用水煮醇提法制备，提取浓缩成含生药为1 g/mL的柴胡加龙骨牡蛎汤，置于冰箱中备用。

1.1.3 材料与仪器 PTZ(美国Sigma公司，美国，货号：P6500-25G)；杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)(美国Hyclone公司，美国，货号：SH30022.01B)；胎牛血清(美国Gibco公司，美国，货号：10270-106)；0.25%胰蛋白酶、抗荧光衰减封片剂(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)、小鼠前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)酶联免疫吸附试验分析试剂盒和小鼠环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)酶联免疫吸附试验试剂盒(中国Bioswamp公司，货号：PAB180002、PAB180018、MU30391、MU30589)；小鼠抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)单克隆抗体、兔抗COX-2多克隆抗体和兔抗PGE2受体(Prostaglandin E Receptor 2，PTGER2)(英国Abcam公司，英国，货号：ab10062、ab52237、ab167171)；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体(美国CST公司，美国，货号：2118)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜和化学发光试剂(美国Millipore公司，美国，货号：IPVH00010、WBKLS0010)。超净工作台(苏州金净净化设备公司，型号：SW-CJ-2D)；显微镜(日本Nikon公司，型号：TS100-F)；荧光显微镜(日本Olympus公司，日本，型号：AX53)；酶标仪(芬兰雷勃公司，芬兰，型号：MK3)；全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司，型号：Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海马星形胶质细胞分离及培养 取孕20 d的清洁级小鼠，处死后取出胎鼠，乙醇消毒后取出海马组织于含DMEM的离心管中。将组织剪成1 mm3的组织块，0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化，175× g，离心5 min，弃上清，并用DMEM重悬细胞。使用200目孔径的不锈钢网除去未消化组织，收集细胞于含10%胎牛血清的DMEM中，培养90 min后采用差速贴壁分离技术去除成纤维细胞。调整细胞密度为5×105个/mL，接种于培养瓶中，培养箱培养24 h后换液，以后隔3 d换1次。待细胞融合达70%～80%时，进行传代培养。

1.2.2 星形胶质细胞鉴定 将单细胞悬液接种于放置有细胞爬片的培养皿中，培养过夜。取出培养皿，磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗后加入4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5% Triton X-100室温通透20 min，再加入5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)封闭1 h。加入一抗稀释液(GFAP稀释比1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗后加入二抗稀释液，室温孵育1 h后，PBS清洗。取一块干净的载玻片，滴一滴抗荧光衰减封片剂(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)。用镊子取出盖玻片，吸去多余的液体，细胞朝下，贴在载玻片上，置于荧光显微镜下观察。

1.2.3 分组及处理 将鉴定成功的海马星形胶质细胞以5×105个/mL的密度接种于6孔板中，培养48 h后，采用无血清DMEM培养24 h。将细胞分为4组：对照组、PTZ组、PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤低剂量组和PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组。PTZ组采用10 mmol/L的PTZ刺激细胞2 h。PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤低剂量组和PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组细胞在10 mmol/L PTZ刺激2 h后，分别采用10 mg/L和20 mg/L的柴胡龙骨牡蛎汤预处理细胞6 h，再用10 mmol/L PTZ刺激2 h。

1.2.4 酶联免疫吸附试验检测COX-2/PGE2水平 根据酶联免疫吸附试验试剂盒说明进行，测定标准品和各组细胞培养液上清于450 nm处的光密度(Optical Density，OD)值，绘制标准曲线得到直线回归方程式后计算各组细胞培养液中COX-2和PGE2浓度，每组设置3个复孔。

1.2.5 蛋白质印迹法检测细胞内COX-2/PGE2表达水平 采用放射免疫沉淀试验(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解试剂盒(材料部分未提及)提取各组细胞总蛋白，蛋白定量后取20 μg上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗稀释液(COX-2稀释比：1∶1 000；PTGER2稀释比：1∶5 000；GAPDH稀释比：1∶1 000)，室温孵育1 h。清洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h后清洗。将膜置于暗室中，加入化学发光试剂，于全自动化学发光分析仪中检测。

2 结果

2.1 小鼠海马星形胶质细胞形态观察及鉴定 分离培养的小鼠原代海马星形胶质细胞贴壁生长，大部分细胞胞突外伸，且长短不一。见图1A。免疫荧光染色显示，细胞呈GFAP阳性表达，鉴定细胞为星形胶质细胞。见图1B。

图1 海马星形胶质细胞形态观察(×100)

2.2 柴胡龙骨牡蛎汤对COX-2和PGE2的影响 与对照组比较，PTZ组海马星形胶质细胞培养液上清中的COX-2和PGE2浓度显著升高(P<0.01)；与PTZ组比较，PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤低剂量组、PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组海马星形胶质细胞培养液上清中的COX-2和PGE2浓度均呈现显著降低(P<0.01)，且PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组更明显(P<0.01)，有剂量依赖性。见表1。

表1 各组海马星形胶质细胞培养液上清中COX-2和PGE2浓度比较

与对照组比较，PTZ组海马星形胶质细胞COX-2/PTGER2蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。而经过柴胡龙骨牡蛎汤干预后，显著抑制了PTZ组海马星形胶质细胞内COX-2/PTGER2的蛋白表达水平(P<0.01)，且有一定的剂量依赖性，PTZ+柴胡龙骨牡蛎汤高剂量组效果更明显(P<0.01)。见表2。

表2 各组海马星形胶质细胞COX-2和PTGER2蛋白表达水平比较

3 讨论

由于长期服用西药抗癫痫，产生多种不良反应，导致部分患者不能耐受，使得中药治疗癫痫受到了医学界越来越多的关注[11]。大量研究显示中医药在抗癫痫方面具有独特的优势[12-15]。柴胡加龙骨牡蛎汤可协调阴阳、祛痰调气、定志摄神，令痫症不作[9]。研究显示，柴胡龙骨牡蛎汤具有多系统、多成分、多靶点的特点，有较好的抗癫痫疗效[16-17]。柴胡龙骨牡蛎汤治疗癫痫作用机制的研究报道较少，因此，本研究对其抗癫痫机制进行了初步探讨。

癫痫发作后会发生星形胶质细胞的激活，而激活后的星形胶质细胞产生和释放神经递质、炎症介质等，对神经元具有毒性作用，进而在癫痫、帕金森病、缺血性脑损伤等多种神经系统疾病的发生发展过程发挥重要的促进作用[18]。因此，星形胶质细胞的活化可作为癫痫的病理标志，可能成为药物治疗癫痫的新靶点[19]。前期研究发现，PTZ可诱导小鼠海马星形胶质细胞的活化，本研究在PTZ诱导活化星形胶质细胞的基础上，进一步检测了星形胶质细胞炎症介质COX-2/PGE2的表达。

COX-2是炎症反应激活指标，在癫痫发作过程中，COX-2表达上调，其过度表达通常与急性条件下的神经毒性和组织损伤有关[20-21]。COX-2激活后可促进癫痫活动诱导的神经元损伤死亡，降低癫痫发作的阈值，进而促进癫痫的反复发作，而阻断COX-2的信号级联后可提高抗癫痫药物的脑渗透能力并克服耐药性[22-23]。前期实验结果显示COX-2与难治性癫痫有密切的关系，干预COX-2炎症反应通路可能成为治疗难治性癫痫的治疗方向[24]。组织受损诱发炎症反应，导致大量花生四烯酸释放，而COX可将花生四烯酸转化为前列腺素[25]。PGE2作为COX-2炎症反应通路中一种重要的炎症效应物，在多种慢性中枢神经系统疾病(包括癫痫)中，通过其受体亚型EP2(前列腺素类激素受体)介导大脑炎症和组织损伤[21]。Zhu等[25]研究发现，COX-2/PGE2信号通路介导的神经炎症和神经元损伤是PTZ点燃癫痫小鼠认知功能障碍的原因之一，认为在癫痫患者的大脑中靶向COX-2/PGE2信号通路可能会产生减轻神经元损伤和预防认知功能障碍的效果。本研究结果显示，PTZ诱导的星形胶质细胞内COX-2/PGE2通路表达显著升高，经过不同剂量的柴胡龙骨牡蛎汤治疗后，COX-2、PGE2表达下调，柴胡龙骨牡蛎汤高剂量效果更明显，提示柴胡龙骨牡蛎汤可有效抑制星形胶质细胞内COX-2/PGE2信号通路的表达水平。

综上所述，柴胡龙骨牡蛎汤可下调PTZ诱导的星形胶质细胞COX-2/PGE2信号通路的表达，该作用可能参与了柴胡龙骨牡蛎汤治疗癫痫的作用机制。