陈云珍 张晶晶

年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种因光感受器-视网膜色素上皮(RPE)复合体退行性病变所致的黄斑区病变，是老年人群中常见的影响视力和生活质量的眼病，能够引起进行性、不可逆性中心视力丧失。据估计，2020年全球AMD患者多达1.96亿人，而2040年AMD患者预计可能不少于2.88亿人[1]。北京市2012年流行病学调查资料显示，首都地区40岁以上人群AMD患病率为4.5%，其中60岁以上人群患病率超过10%[2]。

N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)是脂褐素中的一种主要成分，能够随着年龄的增加沉积于RPE细胞中,并可能通过慢性光化学作用损伤局部视网膜，从而导致AMD的发生[3-4]。现有的研究已发现自噬参与了AMD的某些发病过程，如在细胞水平发现，自噬可能参与了RPE细胞氧化应激后的清除过程[5-6]；饥饿、低氧状态和炎症都可以诱导自噬的发生，自噬还可能参与了新生血管化的调控过程[7-9]，但A2E与自噬的相关研究却鲜有报道。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种重要的信号转导分子，参与多种生理及病理过程。近年来研究发现，Akt/mTOR信号通路的激活对自噬囊泡的形成及成熟具有明显的抑制作用[10]。雷帕霉素是最早发现的mTOR抑制剂，可特异性阻断mTOR对于自噬的抑制作用，在体外或体内实验都可有效地激活细胞自噬，是理想的自噬诱导剂。本研究拟探讨雷帕霉素对A2E诱导RPE细胞自噬调节的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分组取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)(美国ATCC公司)，用含体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司)的DMEM-F12培养基(美国Sigma-Aldrich公司)进行培养，培养基中添加青霉素和链霉素。将细胞置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养，每隔2 d更换培养液，当细胞融合度达80%～90%时，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代用于实验。

将细胞随机分为4组，对照组：仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育的ARPE-19细胞；A2E组：将ARPE-19细胞置于含20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养基中孵育12 h；雷帕霉素组：使用含100 nmol·L-1雷帕霉素(美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后，再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h；雷帕霉素联合A2E组：先使用100 nmol·L-1雷帕霉素预处理细胞1 h，再将细胞放入含20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养基孵育12 h。

1.2 CCK-8法检测细胞增殖情况取ARPE-19细胞，按每孔5000个接种于96孔板中，静置24 h后分组处理，每组设5个复孔，之后用PBS清洗细胞2次，再用100 μL含100 g·L-1CCK-8(日本Dojindo公司)的DMEM-F12培养基于37 ℃继续培养细胞2 h，然后用酶标仪检测各组样品在450 nm波长下的光密度，计算各组细胞生存率。实验独立重复3次。

1.3 各组细胞因子含量检测使用Procarta细胞因子分析试剂盒(美国Panomics公司)，根据说明书步骤检测各组ARPE-19细胞培养上清液中各细胞因子含量(鉴于雷帕霉素为公认的自噬激活剂，而Procarta细胞因子试剂盒仅能同时放下三组样本，故本研究未检测雷帕霉素组细胞中各细胞因子含量)。在滤板的每孔中加入50 μL抗体磁珠，用洗涤液冲洗。每孔加细胞培养上清液50 μL，室温孵育至少1 h后加25 μL抗体溶液。用Luminex 200仪器(美国Bio-Rad公司)进行各细胞因子含量检测。检测的10种细胞因子分别为细胞间黏附分子(ICAM)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、血管生成素2(Ang-2)、血小板衍生生长因子(PIGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGF)和VEGFA。

1.4 透射电镜观察细胞超微结构取对数生长期的ARPE-19细胞，分组处理后终止培养，倒掉培养液，将各组细胞用预冷的PBS洗2次；用细胞刷刮下细胞，2000 r·min-1离心10 min，弃上清，将4 ℃预冷的体积分数2.5%戊二醛固定液沿管壁缓慢加入沉淀的细胞中(勿冲散细胞团)，固定2 h后转移到PBS中保存1～2 h，PBS洗3次；将样品加入4 ℃预冷的体积分数1%锇酸固定液中，4 ℃固定2 h，PBS洗3次，梯度酒精脱水；用环氧树脂浸透包埋样品，超薄切片机切片；随后进行醋酸铀和柠檬酸铅双染色，在透射电镜下观察自噬体并拍照。

1.5 Western blot检测Beclin-1和P62蛋白的表达对数生长期的ARPE-19细胞分组处理后，将收获的ARPE-19细胞溶解在RIPA缓冲液，15 000 r·min-14 ℃离心30 min，采用BCA法对样品进行蛋白定量检测。用50 g·L-1脱脂奶粉封闭膜1 h，加兔抗Beclin-1和兔抗P62(稀释度均为11000；美国Abcam公司)一抗4 ℃孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗(稀释度为13000；美国Cell Signaling Technology公司)在室温下共孵育1 h。利用ImageJ软件分析自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达。实验重复3次。

1.6 免疫荧光染色检测LC3蛋白的表达取对数生长期的ARPE-19细胞，以40×106个·L-1的密度接种于24孔板，孔板内置入载玻片，用DMEM-F12完全培养基常规培养细胞24 h后，分组处理细胞，之后取出细胞爬片，室温下用40 g·L-1多聚甲醛PBS固定10 min，用1 g·L-1DAPI 对细胞核进行反染，PBS洗3次，之后采用荧光淬灭封片剂封片，在暗室中使用荧光显微镜观察各组细胞自噬标志物LC3蛋白表达(绿色荧光斑点)。

1.7 统计学分析采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示。多组间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两组间的比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组ARPE-19细胞生存率将对照组ARPE-19细胞的生存率设为100%，则雷帕霉素组、A2E组和雷帕霉素联合A2E组的细胞生存率分别为(102.50±9.41)%、(65.81±9.04)%和(93.10±11.92)%。与对照组相比，雷帕霉素组ARPE-19细胞生存率无明显变化(P>0.05)；A2E组ARPE-19细胞生存率下降了34.19%，细胞增殖受到明显抑制(P<0.001)；而雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞生存率仅下降了6.90%，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),与A2E组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，提示100 nmol·L-1雷帕霉素能够在一定程度上降低A2E对ARPE-19细胞造成的损伤。

2.2 各组ARPE-19细胞培养上清液中各细胞因子含量与对照组相比，A2E组ARPE-19细胞培养上清液中ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、PIGF、IGF-1、TGF和VEGFA等10种细胞因子含量均明显升高(均为P<0.001)。与A2E组相比，雷帕霉素联合A2E组细胞培养上清液中10种细胞因子含量均有所下降(均为P<0.01)，提示雷帕霉素抑制了A2E诱导的各细胞因子的分泌(图1)。

图1 各组细胞培养上清液中各细胞因子含量 对照组含量设为1。**P< 0.01，***P<0.001。

2.3 各组ARPE-19细胞超微结构与对照组相比，雷帕霉素组ARPE-19细胞内出现散在自噬囊泡，A2E组ARPE-19细胞内出现较多的自噬囊泡；雷帕霉素联合A2E组则可见大量聚集的大体积的自噬囊泡，提示雷帕霉素能够刺激ARPE-19细胞自噬的发生(图2)。

图2 各组ARPE-19细胞超微结构 A：对照组；B：雷帕霉素组；C：A2E组；D：雷帕霉素联合A2E组。

2.4 各组ARPE-19细胞中自噬相关蛋白的表达与对照组相比，A2E组ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.001)，P62蛋白相对表达量显著降低(P<0.001)。与A2E组相比，雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白相对表达量明显升高(P<0.01)，而P62蛋白相对表达量明显降低(P<0.001)(图3)。

图3 各组ARPE-19细胞中Beclin-1和P62蛋白相对表达量 **P< 0.01，***P< 0.001。

2.5 各组ARPE-19细胞内LC3蛋白的表达荧光显微镜下观察LC3蛋白的绿色荧光斑点结果显示，雷帕霉素组ARPE-19细胞内绿色荧光斑点数量与对照组相比无明显变化；而A2E组ARPE-19细胞内出现多个明亮的绿色荧光斑点；雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内绿色荧光斑点大量聚集，与A2E组相比荧光强度增加，斑点体积更大，数量也更多(图4)。

图4 荧光显微镜下观察各组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点

3 讨论

在AMD的发病过程中，RPE渐进性的功能障碍起着至关重要的作用[11]。随着年龄增长，RPE层发生一系列变化，早期的AMD以RPE细胞脂褐素的积聚及色素紊乱为特征，随着疾病的进展，晚期出现RPE细胞数量减少及功能障碍、脉络膜新生血管形成、RPE层脱离等，此时会出现明显的中心视力下降。

现有的研究已证实，自噬通量的降低与RPE的变性及AMD的发病密切相关[12]，但自噬在AMD中的具体作用，不同的研究结果却不尽相同。Yao等[13]在高糖诱导的氧化应激环境下用透射电镜观察到RPE细胞中出现大量的双层膜囊泡，说明高糖可以诱导RPE细胞的自噬；用MTT法检测高糖诱导的自噬未显著改变细胞活力，但对于ATG5缺陷的RPE细胞，高糖可以导致细胞活力明显丧失，说明自噬在高糖环境下对RPE细胞起保护作用。但与之相反的是，Li等[14]研究发现，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)会以一种自噬依赖性途径来减弱自噬，从而降低UVB照射对RPE细胞带来的损害；研究者将RPE细胞置于不同UVB照射强度下观察到LC3-II的表达随照射剂量的增加而升高；EGCG可以显著减少UVB照射环境下RPE细胞的死亡；利用RNA干扰技术导致Atg5沉默的RPE细胞，将其与未处理过的RPE细胞共同用UVB照射24 h后，两组RPE细胞的活力均降低；用EGCG分别作用两组细胞，观察到对照组细胞LC3-II水平降低，而Atg5沉默组细胞LC3-II水平没有改变，说明EGCG是通过自噬依赖性途径来减弱UVB介导的自噬，从而保护RPE细胞抵抗UVB带来的毒性作用的。Krohne等[15]利用脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛(HNE)及丙二醛(MDA)诱导RPE细胞的溶酶体功能障碍，探索了有吞噬功能的光感受器外节(POS)是否会影响脂褐素形成和自噬的活性，他们发现，当溶酶体及自噬功能异常时会减少脂褐素的清除，加剧脂褐素的积累，从而加速AMD的发生。张晶晶等[16]研究证实，20 μmol·L-1A2E能够诱导ARPE-19细胞自噬的发生，同时该浓度A2E能够抑制RPE细胞的增殖，并刺激多种炎症、血管相关细胞因子的分泌。为了进一步验证自噬在A2E引起的RPE细胞损伤这一过程中究竟扮演何种角色，我们应用自噬激活剂雷帕霉素作用于RPE细胞，进行了本部分的研究。

TOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以调控细胞周期、生长和增殖，是细胞自噬调控的关键蛋白。TOR通过感受细胞的多种转导信号变化，对相关自噬分子进行整合，在启动自噬发生时起关键作用[10]。mTOR是TOR的同源物，当其处于活化状态时，通过磷酸化来抑制自噬起始分子Ulkl的功能，从而控制自噬的发生，二者形成两种复合物，分别是mTORC1和mTORC2，其中，mTORC1是调控自噬的主要因素。在哺乳动物体内，TOR可以感受细胞不同的能量变化，当能量充足时，激活细胞内的mTORC1，从而抑制自噬的发生；当细胞受到饥饿信号刺激时，mTORC1失活，整个蛋白复合体构象发生改变，最终诱导细胞发生自噬[17-18]。雷帕霉素是第一个被发现的mTOR通路抑制剂，分子式为C51H79NO13，作为一种传统的大环内酯类抗生素，雷帕霉素在上世纪70年代用作抗真菌药物，1999年获得美国FDA认证，用于抵抗器官移植患者的急性免疫排斥反应[19]。近些年，雷帕霉素及其类似物抗肿瘤活性和抗衰老的功能逐步被发现，对于糖尿病、心血管病等也有一定的作用，并逐步应用于相关的临床治疗[20-22]。Shen等[23]研究发现，PADI4通过介导mTOR信号通路，调控自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3BⅠ和LC3BⅡ的表达，能够保持细胞活性，延缓阿尔茨海默病所致的衰老。另一项研究显示，肉豆蔻提取物能够通过激活mTOR通路，引起自噬相关蛋白P62的增加和LC3的减少，进而防止衰老过程中骨骼肌质量的损失[24]。

本研究结果显示，雷帕霉素能够进一步促进A2E诱导的RPE细胞自噬活性，在一定程度上降低A2E对RPE细胞造成的损伤作用，并抑制了炎症因子及新生血管因子的分泌。结合前期的研究结果我们得出结论，A2E早期通过诱导自噬的发生避免细胞的损伤，但随着作用浓度和作用时间的延长，A2E能够抑制RPE细胞的增殖，并刺激多种炎症因子和新生血管因子的分泌。本研究利用雷帕霉素进一步激活自噬的发生，发现能够增强RPE细胞的活性，部分炎症因子和新生血管因子的表达水平下降。因此我们认为，早期激活自噬通路能够降低A2E对细胞的损伤作用，起到了保护作用，这为降低A2E过度沉积导致的细胞损伤和病变发生提供了新的思路。但是，自噬在AMD中的具体作用机制尚未完全明确，以自噬作为治疗靶点尚存在一些难点，如自噬是存在于所有细胞中的基础生理程序，过少的自噬可影响细胞的正常功能，而过多的自噬则导致自噬性死亡，如何精确调控细胞内自噬的程度尚不清楚。雷帕霉素虽然在细胞和动物实验中取得了令人欣喜的成果，但其较多的不良反应限制了其在临床中的应用，如何避免雷帕霉素的这些不良反应或者开发新的具有较少不良反应的自噬诱导剂尚需进一步探索。