闪雅惠，邓梅毓，郭志青，雷雪超，梁国彩

(河北北方学院附属第一医院呼吸与危重症医学科，河北 张家口 075000)

肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和病死率近年来不断增加[1]。其中，非小细胞肺癌是最常见的肺癌组织学类型，占肺癌的84%，主要包括肺鳞状细胞癌和肺腺癌两种亚型[2]。根治性切除被认为是早期肺腺癌的首选治疗方法，但仍存在一定的复发风险以及远处转移[3]。近年来，越来越多的癌症患者接受手术和麻醉以治疗癌症和控制疼痛[4]。顺阿曲库铵(cisatracurium，Cisat)是一种新开发的非去极化肌松药，已广泛应用于临床麻醉。Cisat的松弛强度为阿曲库铵的4～5倍，具有疗效好、毒性低、代谢不依赖肝肾等特点，已成为最理想的肌松药[5]。最近研究发现，Cisat在癌症的发展进程中发挥着重要作用，Yang等[6]研究证实Cisat对乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有抑制作用；Xia等[7]的研究结果证明Cisat可通过抑制TGF-β/SMAD2/3信号通路的激活从而抑制结肠癌进展。但是，对于Cisat在肺腺癌进展中的作用目前尚不清楚。因此，本研究主要探讨Cisat对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响，以期为临床肺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Cisat(批号：20200810)购自江苏东英药业有限公司；结晶紫、CCK-8试剂盒、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)检测试剂盒(JC-1)购自美国sigma公司；RPMI 1640培养基(批号：22400097)、FBS(批号：12664025C)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；caspase-3(批号：ab184787)、caspase-9(批号：ab184786)、Bax(批号：ab32503)、Bcl-2(批号：ab32124)、纤连蛋白(批号：ab268020)和GAPDH(批号：ab181602)抗体购自英国Abcam公司；抗波形蛋白(批号：bs-8533R)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(批号：bs-34032R)、c-Myc(批号：bs-4963R)、p21(批号：bsm-60698R)抗体购自北京博奥森公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(批号：ZB-2301)购自北京中杉金桥公司；Transwell小室(带基质)购自美国BD公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 细胞培养

人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海)，将细胞置于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、含5%CO2的湿润条件下培养。

1.3 CCK-8法检测细胞活力

将A549细胞以1×103个/孔的密度接种到96孔板中，加入不同浓度(1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L、320 μmol/L)的Cisat。培养24 h后，加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶标仪读取450 nm波长处的OD值。计算细胞存活率，细胞存活率=(加药组细胞OD值/0 μmol/L细胞OD值)×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.4 克隆形成实验检测细胞增殖能力

将Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549细胞稀释后缓慢加入并分散于细胞培养板上。培养14 d后，PBS洗涤细胞2次，甲醇固定细胞，0.1 %结晶紫染色。然后对可见菌落进行计数。

1.5 Annexin-V/PI法检测细胞凋亡

将Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549细胞用PBS调整细胞浓度为5×105个/孔，并接种至12孔板，分别加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，室温避光孵育15 min，使用BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪对样品进行分析，Flow Jo 7.6软件分析结果。

1.6 流式JC-1检测MMP[8]

将Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L孵育的A549细胞用PBS调整细胞浓度至1×106/mL，加入终浓度为10 μg/mL的JC-1，于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔5 min颠倒混匀，PBS洗涤3次，使用BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪对样品进行分析，激发波长为488 nm，用Flow Jo 7.6软件分析结果。

1.7 Western blot检测蛋白表达

将Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L处理的A549细胞用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。BCA测定蛋白浓度并调平，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(80 V，40 min；120 V，1 h)分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脱脂牛奶在TBST中封闭2 h后，加入一抗caspase-3、caspase-9、c-Myc、p21、Bax、Bcl-2、VEGF、纤连蛋白和波形蛋白(均按1∶1 000的比例稀释),于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜后ECL曝光成像并用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

1.8 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

细胞侵袭通过涂有基质的Transwell小室确定。在无血清培养基中，将Cisat 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L孵育的A549细胞以2×104个/孔的密度接种到Transwell的上室中。Transwell的下室装有含10% FBS的RPMI 1640培养基。37 ℃下孵育48 h后，用棉签剥离Transwell顶部未侵袭的细胞，而Transwell下部的侵袭细胞则用4%多聚甲醛固定20 min，然后用1%结晶紫染色15 min。在光学显微镜(Olympus)下随机选择5个区域对入侵的细胞进行计数。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的Cisat对A549细胞活力的影响

A549细胞活力随Cisat浓度的增加而降低，Cisat浓度为0 μmol/L时，A549的细胞活力为100%，Cisat浓度为40 μmol/L时，A549细胞活力显著下降(P<0.05)，见图1。因此，选择0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L Cisat进行后续实验。

*：与0 μmol/L相比，P<0.05

2.2 Cisat对A549细胞克隆形成的影响

与Cisat 0 μmol/L组相比，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组A549细胞克隆形成率显著降低(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L组无明显变化(P>0.05)，见图2。

a：克隆形成实验检测A549细胞增殖；b：各组细胞克隆形成率统计 *：与Cisat 0 μmol/L组相比，P<0.05

2.3 Cisat对A549细胞凋亡的影响

与Cisat 0 μmol/L组相比，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L组无显著变化(P>0.05)，见图3a。Cisat 0 μmol/L组JC-1红绿荧光比值接近100%，与之相比，Cisat 20 μmol/L组红绿荧光比值无明显变化，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组JC-1红绿荧光比值明显降低，即MMP显著降低，见图3b。

a：流式细胞术检测细胞凋亡；b：JC-1检测细胞MMP *：与Cisat 0 μmol/L组相比，P<0.05

2.4 Cisat对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与Cisat 0 μmol/L组相比，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9、Bax/Bcl-2比值及p21的表达均显著上调(P<0.05)，c-Myc的表达显著下调(P<0.05)，而Cisat 20 μmol/L组无显著变化(P>0.05)，见图4。

a：Western blot检测各组细胞中凋亡相关蛋白的表达；b：各组蛋白相对表达量统计 *：与Cisat 0 μmol/L组相比，P<0.05

2.5 Cisat对A549细胞侵袭能力的影响

与Cisat 0 μmol/L组相比，Cisat 20 μmol/L组细胞侵袭数无显著变化(P>0.05)，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组细胞侵袭数目显著减少(P<0.05)，见图5a、b。与Cisat 0 μmol/L组相比，Cisat 20 μmol/L组VEGF、纤连蛋白和波形蛋白的表达无明显变化(P>0.05)，Cisat 40 μmol/L组和Cisat 80 μmol/L组VEGF、纤连蛋白和波形蛋白的表达均显著下调(P<0.05)，见图5c、d。

a：Transwell检测细胞侵袭能力(×200)；b：各组侵袭细胞数统计；c：Western blot检测VEGF、纤连蛋白和波形蛋白的表达；d：各组蛋白相对表达量 *：与Cisat 0 μmol/L组相比，P<0.05

3 讨论

肺腺癌的治疗方案通常为手术切除辅以化疗，但残留的癌细胞可能导致术后复发和转移的发生率变高，是患者死亡的主要原因[9]。这些残留癌细胞的生存和进展取决于多种协同围术期因素，其中包括麻醉药和止痛药[10]。因此，优化手术和麻醉策略至关重要，这可能是减少手术切除后肺癌复发的关键。Cisat是一种非去极化的肌松药，通常用于需要有效骨骼肌麻痹的手术中。有研究证明，Cisat可显著抑制人卵巢癌OVACR-3细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡[5]。本研究结果显示，A549细胞活力随着Cisat浓度的增加逐渐降低，Cisat浓度在40 μmol/L及以上时，A549细胞活力明显降低，因此，高浓度Cisat可抑制肺癌细胞活力。

MMP的下降是细胞早期凋亡的一个标志性事件。当MMP下降，线粒体膜通透性增加，细胞色素C释放到胞内后形成凋亡复合体，凋亡复合体通过招募并激活caspase-9，caspase-9进一步激活效应caspase-3和caspase-7，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡[11]。据报道，c-Myc蛋白与肿瘤的发生有关，c-Myc过度表达对细胞增殖、存活、肿瘤血管生成和肿瘤转移有积极的调节作用，此外c-Myc还可介导细胞程序性凋亡的发生[12-13]。本研究结果显示，MMP随着Cisat浓度的增加而显著下降，且cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9表达上调，c-Myc表达明显下调。说明Cisat能够降低A549细胞MMP，从而引发细胞早期凋亡。

据报道，肿瘤抑制因子p21低表达是肿瘤发生的先决条件[14]。研究表明，激活p21表达可导致膀胱癌细胞中的G0/G1期细胞周期停滞[15]。Bcl-2家族蛋白是控制线粒体相关的凋亡因子释放的主要调节因子[16]，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2比值决定了细胞凋亡与否[17]。本研究中，Cisat浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时细胞克隆形成率明显降低，p21表达及Bax/Bcl-2比值显著上调。说明Cisat可以抑制A549细胞的增殖并促进其凋亡。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤恶性转化中起关键作用，而纤连蛋白和波形蛋白是EMT的重要标志物[18]。VEGF是关键的血管生成因子，可使血管通透性增加，引起肿瘤血管中的蛋白外渗，有助于肿瘤生长、转移[19]。研究发现，Cisat可抑制食管癌细胞中的EMT[20]。本研究结果显示，Cisat显著下调了纤连蛋白、波形蛋白和VEGF的表达，表明Cisat可通过抑制A549细胞发生EMT阻遏肿瘤的侵袭和转移。

综上，本研究首次揭示了Cisat在抑制A549细胞增殖、侵袭、迁移和EMT以及诱导细胞凋亡中的重要作用，对于需要充分肌肉松驰或持续控制通气的肿瘤切除术，这些发现具有广阔的应用前景。然而，本研究仅使用单一的肺腺癌细胞系进行实验，未来还需要对更多的细胞系进行综合分析，以了解Cisat在肺癌中的作用。