王丽梅

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染导致的结核病(tuberculosis, TB)仍是威胁全球人类健康的传染病第一杀手。2020年WHO报道，全球新发TB患者约1 000万，死亡患者约140万。我国是TB高负担国家，TB患者数位居世界第3[1]。卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)是目前用于预防TB的唯一疫苗，但只能保护儿童的粟粒性结核和结核性脑膜炎，对成人TB没有保护效果[2]。因此，研制更为有效的新型TB疫苗成为防控TB迫切需要解决的问题。

MTB是一种主要经呼吸道传播的病原体。近年来研究表明，呼吸道黏膜免疫是机体抵抗MTB感染的第一道防线[3]。传统BCG主要经皮内或皮下免疫接种，以诱发全身系统性的免疫应答为主，而对黏膜免疫系统尤其是呼吸道黏膜免疫系统的刺激作用较小[3]。因此，通过黏膜免疫诱导黏膜免疫系统产生抗MTB感染的特异性免疫，成为了当前TB疫苗研究的新方向。由于黏膜免疫系统具有屏障结构、多种酶物质和免疫耐受，所以如何有效地将抗原递送至黏膜免疫系统，并刺激产生高效特异的黏膜免疫反应成为了黏膜疫苗研究的技术关键。本文根据近年来TB黏膜疫苗的研究报道，总结了不同类型抗原递送载体的TB黏膜疫苗的特点、免疫学特性和保护效果，并分析了未来TB黏膜疫苗的发展趋势，希望对研究更高效的新型TB黏膜疫苗有所启示。

1 重组病毒载体疫苗

1.1 痘病毒载体疫苗 痘病毒载体的主要特点是可以容纳较大的外源基因片段，但其表达外源抗原的水平较低。此类疫苗主要用于初免后的加强免疫[4]。White等[5]利用人工致弱毒株改良安卡拉痘苗病毒(modified vaccinia virus ankara，MVA)构建了表达MTB Ag85A抗原的重组痘病毒MVA85A，并在恒河猴模型中比较了MVA85A经皮内注射和气溶胶雾化后经鼻黏膜免疫加强BCG初免的效果。研究结果表明，MVA85A经鼻黏膜免疫能显著提高BCG皮内初免恒河猴的肺泡灌洗液中CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量，提供更好的抗MTB感染的免疫保护效果，且安全性也好。该研究也发现，MVA85A经鼻黏膜免疫在恒河猴体内不会诱生MVA载体的特异性抗体，这一点对于以MVA为载体的疫苗开发具有重要意义。目前经黏膜免疫的MVA85A被作为ChAdOx185A初免的加强型疫苗，正在进行Ⅰ期临床试验研究[1]。

1.2 腺病毒载体疫苗 复制缺陷的腺病毒载体疫苗是目前研究最为广泛和深入的一类病毒载体疫苗。腺病毒载体具有很强的免疫原性，既可以激活固有免疫，也可以激活适应性免疫，能诱导机体对其递送的抗原产生特异性的细胞免疫。重组腺病毒载体疫苗不仅适用于对新生儿进行初免，也适用于在BCG免疫过的人群中进行加强免疫，且在HIV感染等免疫缺陷者体内也是一种相对安全的疫苗形式[6]。加拿大Xing Z研究组较早开展了基于腺病毒载体的TB黏膜疫苗研究，他们构建了表达MTB Ag85A抗原的人腺病毒5型复制缺陷的重组载体AdAg85A，并在多种动物模型中评价了AdAg85A的免疫学特性和免疫保护效果[7-11]。研究发现，AdAg85A经肌肉注射免疫小鼠后，在小鼠脾肺组织中能够诱生抗原特异性的T细胞免疫应答，但不能在小鼠的呼吸道中诱生抗原特异性T细胞，不能保护小鼠抵抗经呼吸道感染的MTB[6]。然而，将AdAg85A经黏膜滴鼻免疫小鼠[7]、豚鼠[8]、牛[9]、羊[10]和恒河猴[11]等多种动物模型后，虽然与经肌肉注射相比，诱生全身系统性免疫的抗原特异性T细胞强度较低，但却能在这些动物的气道腔、肺组织中显著诱生抗原特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞。AdAg85A经黏膜免疫主要以诱生CD8+T细胞为主，且这些CD8+T细胞是一类持久的效应记忆性T细胞，能够明显降低脾、肺组织的MTB荷菌数，保护小鼠抵抗经呼吸道感染的MTB，加强BCG皮下初免的效果。另外，在恒河猴模型中的研究还发现，AdAg85A黏膜免疫加强BCG皮内初免，可显著缓解恒河猴MTB感染的临床症状和肺组织损伤，改善存活状况[11]。目前经黏膜免疫的AdAg85A正在进行Ⅰ期临床试验研究[1]。

为进一步提高疫苗的免疫原性，Xing Z课题组还构建了表达MTB 10.4和Ag85A两种抗原的复制缺陷的人腺病毒5型重组载体疫苗，即Ad-10.4-Ag85A[12]。研究发现，Ad-10.4-Ag85A一次鼻内黏膜免疫就能在小鼠气道腔和肺组织中诱生MTB 10.4和Ag85A 2种抗原特异性的细胞免疫应答，诱生的保护性免疫应答优于表达单一抗原的AdAg85A，具有潜在优势[12]。

由于人体中普遍存在腺病毒5型载体抗体，一定程度上限制了基于该载体的疫苗应用。因此，为了研究更适合人类应用的腺病毒载体疫苗，Xing Z课题组又以黑猩猩腺病毒68型(AdCh68)为载体，构建了表达Ag85A的重组腺病毒AdCh68Ag85A，对比了AdCh68Ag85A与AdAg85A的免疫保护效果。研究结果发现，AdCh68Ag85A滴鼻黏膜免疫小鼠不仅具有良好的安全性，而且在诱生T细胞免疫应答方面也优于AdAg85A。当小鼠肺组织预先存在AdHu5载体抗体时，AdCh68Ag85A比AdAg85A能更好地降低小鼠肺组织的MTB荷菌数，保护小鼠抵抗MTB感染[13]。

1.3 其他类型的病毒载体疫苗 目前还有一些其他类型的病毒载体也被用于TB黏膜疫苗的研究。Roediger等[14]构建了表达Ag85A的重组水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)载体疫苗VSVAg85A。研究发现，VSVAg85A经滴鼻初免小鼠，虽然诱导小鼠产生的抗MTB感染的保护性免疫不持久，但当VSVAg85A用于加强AdAg85A初免时，却可显著增加小鼠气道腔和全身系统性的Ag85A抗原特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量，明显减少小鼠脾肺组织的MTB荷菌数，保护效果优于VSVAg85A、AdAg85A和BCG等疫苗的单独免疫效果。

仙台病毒(Sendai virus, SeV)不感染人类，人体内预先存在的SeV病毒抗体滴度也较低[15]。Hu等[16]以SeV为载体，构建了表达Ag85A和Ag85B抗原的重组病毒载体疫苗SeV85AB，并将其滴鼻黏膜免疫小鼠。研究发现，SeV85AB一次免疫接种就可诱导小鼠产生同BCG免疫相当的保护效果。当SeV85AB黏膜免疫用于加强BCG皮下初免时，SeV85AB能显著降低小鼠脾肺组织的MTB荷菌数，减轻脏器病理损伤，增强BCG皮下初免的保护效果。该研究表明，SeV85AB的免疫保护效果可能与其在小鼠肺组织中诱生的组织记忆性CD8+T细胞相关。

人副流感病毒2型(human parainfluenza type 2 virus，hPIV2)病毒载体刺激机体产生的重组抗原特异性的免疫反应要强于自身病毒载体的[17]。因此，Watanabe 等[18]利用非复制的hPIV2为载体，构建了表达Ag85B的重组载体疫苗rhPIV2-Ag85B。研究发现，rhPIV2-Ag85B滴鼻免疫小鼠，能够在小鼠脾、肺泡灌洗液和肺部淋巴结中显著诱生抗原特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞，减少脾肺组织的MTB荷菌数，减轻肺组织肉芽肿病变和炎症反应，具有作为新型TB疫苗的研究前景。

流感病毒(influenza virus，FLU)载体能够刺激机体黏膜免疫系统和全身系统性免疫产生强烈的免疫反应，目前也被广泛用于各类疫苗的研究[19]。哈萨克斯坦和俄罗斯联合构建了以复制缺陷的甲型流感病毒为载体、表达MTB Ag85A和ESAT-6抗原的重组疫苗TB/FLU-04L。研究发现，该疫苗滴鼻加强BCG初免，一次接种就可以显著增强BCG初免的保护效果。目前TB/FLU-04L正在进行Ⅱa 期临床试验研究[20]。

2 亚单位疫苗

当前亚单位疫苗用于TB黏膜疫苗的研究还比较少。在亚单位疫苗研究中，佐剂的选择以及佐剂和抗原的配伍非常重要，其影响着疫苗诱生的免疫应答的类型和强度。Blazevic等[21]用佐剂CpG辅佐MTB Ag85B抗原滴鼻黏膜免疫小鼠，观察其初免和加强BCG初免的效果。研究发现，Ag85B/CpG经滴鼻免疫比肌肉注射能更多地进入到小鼠肺组织和黏膜皮下组织，但诱生的免疫反应强度还不够保护小鼠抵抗MTB感染。当用Ag85B/CpG滴鼻加强BCG经滴鼻初免的免疫效果时，虽然免疫小鼠肺组织中的抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量有所增加，但小鼠肺泡灌洗液中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量没有改变，不能增强BCG经滴鼻初免的免疫效果。

α-GalCer是一种合成的糖脂，是恒定型自然杀伤性T细胞(iNKT)的激活剂。iNKT细胞能够激活DCs，从而促进抗原的高效递呈，增强适应性免疫应答[22]。Khan等[23]利用α-GalCer作为佐剂配伍MTB Ag85B和ESAT-6抗原，并以舌下含服的方式免疫小鼠，观察其免疫保护效果。研究表明，α-GalCer/Ag85B/ ESAT-6经舌下含服方式免疫小鼠后，能够在小鼠的脾、颈部淋巴结和肺组织中诱生强烈持久的多功能性CD4+T细胞和CD8+T细胞，分泌IFN-γ和IL-2等多种细胞因子，降低MTB感染小鼠的脾肺组织MTB荷菌数，保护效果优于BCG皮下免疫的效果。

3 纳米颗粒疫苗

纳米颗粒疫苗是近年来备受青睐的一种疫苗形式，其不仅能较好地刺激黏膜免疫系统，还能刺激全身系统性免疫系统，显示出良好的疫苗应用前景。Ballester等[24]利用聚丙烯硫化物制成纳米颗粒，然后将MTB Ag85B抗原偶联在纳米颗粒表面，形成纳米颗粒疫苗NP-Ag85B。研究发现，将NP-Ag85B与CpG佐剂一起肺内注射免疫小鼠，与非纳米颗粒递送的Ag85B/CpG相比，NP-Ag85B/CpG能诱生小鼠肺和肺组织引流淋巴结中产生更多的抗原特异性多功能Th1型细胞，并能在小鼠脾肺组织中诱生Th17细胞免疫反应，显著降低MTB感染小鼠的脾肺组织MTB荷菌数。

Hart等[25]利用黄色巴西棕榈蜡制成纳米颗粒，并将MTB Acr、Ag85B和HBHA 3种抗原构成的融合蛋白吸附在纳米颗粒表面，形成纳米颗粒疫苗Nano-FP1。研究发现，Nano-FP1通过滴鼻免疫加强BCG初免，能显著提高BCG初免小鼠抗MTB感染的保护效果，减少感染小鼠脾、肺组织的MTB荷菌数。

壳聚糖是近年来被认为非常有应用前景的一类纳米材质，其生物相容性好，安全无毒，还具有佐剂特性[26]。Ahmed等[27]将壳聚糖纳米颗粒与不同的Th1型细胞免疫佐剂如单磷酰脂质A(MPLA)、多聚凝胶可德兰多糖、聚肌胞苷酸(poly I:C)、瑞喹莫德(R848)、寡聚脱氧核苷酸链(CpG)和肽聚糖(PGN)等进行配伍，然后滴鼻免疫小鼠。结果发现，当壳聚糖纳米颗粒与MPL配伍后，能够激活DCs中的TLR与炎症小体信号通路，介导Th17和Th1型的黏膜免疫反应，保护小鼠抵抗MTB感染。

Ag85B-ESAT-6-Rv2660融合蛋白(H56)与佐剂IC31组成的亚单位疫苗目前正在进行经肌内注射免疫接种的Ⅱa期临床试验研究[28]。Thakur等[29]为了评价H56用作TB黏膜疫苗的免疫效果，将H56与阳离子脂质体佐剂CAF01制成了纳米颗粒疫苗。研究发现，H56/CAF01经肺内注射免疫小鼠，能够均匀地分布在小鼠的肺组织中，并具有较好的安全性。此外，H56/CAF01通过肌肉初免-肺内加强免疫，不仅能诱导小鼠肺组织黏膜和全身系统性的IgA的产生，还能诱导产生多功能的Th1型和Th17型细胞免疫反应，具有良好的研究前景。

另外，Andersen等[30]利用CTA1-DD/ISCOMs复合脂质体佐剂与Ag85B-ESAT-6融合蛋白制备成纳米颗粒疫苗，并将其滴鼻免疫加强BCG皮下初免。研究发现，该免疫方案可在小鼠肺组织中诱导Th1型细胞免疫应答，促进抗原特异性T细胞高效迁移至MTB感染部位，减少感染小鼠肺组织的MTB荷菌数，增强BCG皮下初免的保护效果。

4 其他递送载体的TB黏膜疫苗

目前还有一些其他类型载体的TB黏膜疫苗研究，这些疫苗也都展示出各自的优点。如Copland等[31]在枯草芽孢杆菌的芽孢表面包被了MTB Ag85B、Acr和HBHA抗原的融合蛋白FP1，制备成Spore-FP1疫苗。研究发现，将Spore-FP1滴鼻免疫加强BCG皮下初免，能够诱生小鼠产生多种特异性的黏膜免疫反应和全身系统性的免疫反应，降低MTB感染小鼠肺组织的MTB荷菌数。另外，Mustafa等[32]利用乳酸杆菌构建了表达MTB Ag85B、CFP-10、ESAT-6、Rv0475和Rv2031c等5种抗原的融合蛋白ACERL，又将ACERL与细胞因子IL-12在乳酸杆菌中重组表达，形成LpACERL/IL-12疫苗。结果发现，LpACERL/IL-12经口服黏膜免疫小鼠后，能够显著诱生小鼠脾、肺和肠道的Th1型细胞免疫反应，显示出较好的研究应用前景。

5 展 望

不同于全身系统性免疫，黏膜免疫系统具有特殊的结构和功能，因此怎样能高效激活黏膜免疫系统是黏膜疫苗研究的关键。靶抗原、佐剂和递送系统是黏膜疫苗设计的3个重要因素[33]。靶抗原的选择决定了疫苗的特异性，目前TB黏膜疫苗选择的靶抗原大多是通过全身系统性免疫系统而筛选的，但这些抗原是否仍是黏膜免疫系统的优势保护性抗原目前还不清楚，所以寻找更佳的适于黏膜免疫的MTB保护性抗原有助于TB黏膜疫苗的深入研究[33]。佐剂是黏膜疫苗的重要组成部分，其不仅能增强疫苗的免疫原性，而且还影响着疫苗诱生免疫应答的类型[34]。因此准确选择佐剂，并诱导特定类型的免疫应答，有助于提高TB黏膜疫苗的免疫保护效果。递送系统是将疫苗靶抗原和佐剂递送到黏膜免疫系统，并诱导黏膜免疫系统产生抗原特异性黏膜免疫反应的关键因素[35]。虽然当前在研的TB黏膜疫苗能够诱导黏膜免疫系统产生抗原特异性的免疫反应，但这些疫苗均缺乏黏膜靶向性，如果能提高TB黏膜疫苗对黏膜免疫系统的靶向性，尤其是对呼吸道黏膜免疫系统的靶向性，则对提高黏膜疫苗的免疫效果具有重大的意义。此外，黏膜疫苗免疫接种的部位、途径和免疫顺序(如初免和加强性免疫)等也都影响着疫苗诱导的免疫反应的强度和疫苗的免疫保护效果[36]。所以，未来如果能在MTB靶抗原的选择、使用的免疫佐剂、免疫递送载体及其靶向性、免疫顺序等方面进一步地优化，调节或改变机体的全身系统性免疫与黏膜免疫的免疫应答的类型和强度，将有助于更高效地TB黏膜疫苗的成功研制。

利益冲突：无

引用本文格式：王丽梅. 结核病黏膜疫苗的研究进展[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(2)：170-174，181. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.020