张 乐，张 雅，史冠莹，赵丽丽，蒋鹏飞，王旭增，王赵改,*

（1.河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002；2.中牟润鑫置业有限公司，河南 郑州 451450）

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Roem），又名香椿头、椿树，楝科香椿属，多年生落叶乔木，起源于中国，已有2300多年的栽培历史，自然分布于亚洲地区[1-2]。在我国亚热带至温带的28个省市自治区均有分布和种植，现有栽培面积200余万亩，年产椿芽10余万 t，年产椿木约60万 m3，年产值超100亿 元。由于其独特的风味和很高的营养价值，其嫩芽是中国最受欢迎的木本蔬菜[3]。此外，香椿还含有丰富的萜类、黄酮、皂苷、生物碱等功能性活性成分，具有良好的降血糖、抗炎、抗菌、抗病毒等种药用价值[4-6]。香椿特征风味是其最重要的感官品质指标，决定其食用价值、商品价值及产业前景。香椿挥发性香气组分复杂、种类繁多，包括萜烯类、醛类、醇类、酮类、酯类和含硫类等[7-8]。随着色谱质谱技术的发展，香椿挥发性风味物质研究成为研究热点，主要集中在对其特征香气物质的提取、分离、质谱分析以及品种、干燥方式、烫漂方式等关键香气成分及差异等方面。目前已鉴定出100多种挥发性化合物，主要为硫化物、萜烯类、醛类等。Liu Changjin等[9]报道了2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩（具有与煮熟香椿相似的气味）和二-1-丙烯基硫化物（具有大蒜和洋葱的气味）是新鲜香椿（产地山西）总体香气特征的重要化合物。Zhai Xiaoting等[10]利用气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactrometry，GC-O）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法的静态顶空气香气稀释分析以及香气提取物稀释分析鉴定了新鲜香椿和烫漂香椿中的香气成分，确定了(E,E)-二-1-丙烯二硫化物和(E,Z)-二-1-丙烯二硫化物为关键香气物质。我国香椿种植区覆盖多个省市，各地区气候条件差异较大，例如，位于西南部的四川、贵州具有典型的亚热带季风气候特征，即高山、深谷和常年高湿，而位于北方的河南、山西则属于温带季风气候，以及地形、土壤等使不同自然地生产出的香椿质量不同。史冠莹等[11]对不同产地香椿嫩芽主要营养成分、活性物质及挥发性成分进行分析，各产地差异较大。刘常金等[12]采用GC-MS技术对山东西牟红香椿、河南焦作红香椿、安徽太和黑油椿3 地方品种香椿的挥发性风味成分进行分析，结果表明，其主要噻吩类化合物、萜烯类化合物和酯类化合物的种类及相对含量均存在明显差异。目前针对同一品种不同产区香椿主要挥发性有机化合物的鉴定和比较鲜见报道。

鉴定食品中挥发性香气化合物最常用的仪器分析技术有电子鼻、GC-MS、GC-O[13-14]等。GC-MS是目前分析香椿挥发性化合物最常用的技术手段，该技术在分析前通常需要进行复杂的前处理，要求真空条件，检测时间较长，另外过长的分离时间和过高的检测温度都容易导致目标化合物结构发生变化而无法检出。气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一种新的分离检测技术，具有GC的高分离能力和IMS的快速响应、高分辨、高灵敏度，且样品几乎不需要任何前处理[15-16]。已广泛应用于药物检测[17-18]、环境质量[19-20]、食品风味分析方面[21-22]。因此，本研究采用GC-IMS对8个产区香椿中的挥发性有机化合物进行检测，同时结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和基于偏最小二乘判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）模型的变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）方法对香椿中的关键香气物质进行研究，建立8个产区香椿挥发性香气成分的指纹图谱，实现香椿产地的快速识别，为香椿的品质鉴定和产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香椿，树龄5 a，均为红油香椿品种，分别于2021年3～4月份采自于我国8个地区（表1），陆地头茬，选取新鲜、健壮、无机械损伤、长度15 cm左右的香椿嫩芽，早上七点之前采集完毕，快速预冷，运至实验室，切碎后加液氮研磨，真空包装在食品级聚乙烯塑料储存袋中，在-80 ℃保存直到分析。

正酮C4～C9国药化学试剂北京有限公司；液氮郑州博越商贸股份有限公司。

表1 8个产地香椿样品Table 1 Geographical origins and harvest dates of T. sinensis samples

1.2 仪器与设备

FlavourSpec GC-IMS联用仪（配有分析软件包括LAV和三款插件以及GC×IMS Library Search 1.0.3）德国G.A.S公司；WXT-5毛细管柱（15 m×0.53 mm，0.53 μm） 美国Restek公司；ME204E型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IKA A11研磨机艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-IMS检测

参考Li Mengqi等[23]的方法并作适当调整，精确称取0.500 g香椿样品于20 mL具有聚四氟乙烯隔垫密封的顶空瓶中，将顶空瓶40 ℃加热孵化10 min，孵化转速250 r/min；不分流顶空进样500 μL。进样针温度80 ℃，进样前清洗时间30 s，进样后清洗时间6 min。

GC条件：MXT-5柱（15 m×0.53 mm，0.53 μm）；色谱柱温度40 ℃；载气为高纯氮气（≥99.999%）。载气流速程序为初始2.0 mL/min，保持2 min，在2～10 min线性增至5.0 mL/min，在10～20 min线性增至50.0 mL/min，在20～30 min线性增至100.0 mL/min，然后停止流动，总运行时间为30 min。

IMS条件：漂移管长度98 mm；漂移管温度60 ℃；漂移气为氮气（纯度≥99.999%）；漂移气流速150 mL/min；管内线性电压500 V/cm；放射源β射线（氚）；正离子模式；光谱平均扫描次数12次。

1.3.2 化合物的定性定量分析

使用正酮C4～C9作为外标计算挥发性化合物的保留指数（retention index，RI），通过GC×IMS Library Search软件比对保留指数和GC-IMS库中标准品的漂移时间（离子通过漂移管到达收集器所需时间（ms）），鉴定香椿中挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）。挥发性化合物的强度根据所选信号峰的峰体积进行分析。

1.4 数据处理

采用设备自带的LAV（Laboratory Analyti ca lViewer）分析软件和3 款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件）进行样品分析，以及GC×IMS Library Search软件内置的2014NIST数据库和IMS数据库对风味物质进行定性分析，构建挥发性有机物的差异图谱和指纹图谱。采用SPSS statistics 19软件进行方差分析，P＜0.05，差异显著，在https://www.metaboanalyst.ca/.网站上进行PLS-DA，使用Origin 8.6绘图。

2 结果与分析

2.1 不同产区香椿中挥发性有机化合物GC-IMS分析

使用Reporter插件生成了不同产地香椿中挥发性化合物的GC-IMS二维俯视图，如图1所示，横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰（经归一化处理），反应离子峰右侧的每一个点代表一种挥发性化合物，颜色表示单个化合物的信号强度。红色代表高强度，蓝色代表低强度。由图1可知，大多数信号出现在100～1 000 s的保留时间和1.0～1.7 s的漂移时间。8个产区香椿中的挥发性有机物种类基本一致，但有些挥发性有机物含量差异较大，标注的红色区域内挥发性有机物在湖北、陕西、安徽、河南、山西中含量较多，而在云南、四川、贵州中含量很低甚至不含。

2.2 不同产区香椿中挥发性有机化合物定性和定量分析

利用离子迁移时间和保留指数对挥发性有机化合物进行定性鉴别。由于一些化合物以不同的浓度存在，产生了几个信号，这些信号代表了相应的二聚体甚至三聚体，具有相似的保留时间，但漂移时间不同[23]。在香椿样品中共检测到97个峰，通过软件内置的NIST 2014和IMS数据库鉴定了66个化合物，如表2所示。检测到8种化合物（乙酸乙酯、2-丁酮、2-戊酮、2-甲基丁醛、丙酸乙酯、2,3-戊二酮、丙酸、(E)-2-己烯醛）的单体和二聚体形式以及α-蒎烯的单体、二聚体、三聚体形式。因此，在香椿样品中鉴定出56种化合物，包括11种醛类、8种醇类、8种酮类、4种含硫类和4种酸类、5种烯类、7个酯类以及主要由呋喃和吡嗪组成的9个其他类。挥发性化合物的定量分析由IMS系统计算的峰体积表示。如图2所示，8个产区香椿样品含量最高的均为醇类，且占比均在30%以上，四川地区达39.93%，主要醇类物质有2-己醇、苯乙醇。其次是醛类，除四川地区醛类占14.93 %，其他产区均在20%以上。醛类化合物主要来源于脂肪氧化，氨基酸反应亦是重要来源，且醛类阈值很低[24]，对风味贡献较大。醇类化合物一般来源于脂肪酸的二级氢过氧化物的降解或由羰基化合物还原生成[25]。

图1 8种香椿挥发性有机化合物的GC-IMS二维谱图Fig. 1 Two-dimensional GC-IMS chromatograms of volatile components in T. sinensis samples

表2 8个产地香椿样品中挥发性有机物的GC-IMS结果比较Table 2 Comparisons of volatile components of eight T. sinensis samples detected by GC-IMS

图2 不同产区香椿挥发性香气成分种类和含量Fig. 2 Types and contents of volatile components in T. sinensis from different regions

2.3 不同产区香椿中挥发性成分的指纹图谱分析

虽然图1显示了不同产区香椿中挥发性化合物的变化趋势，但对具体的挥发性化合物难以做出准确的判断。为更直观且定量地比较不同产区香椿样品中的挥发性化合物差异，采用GalleryPlot插件生成不同产区香椿中挥发性成分的指纹图谱，如图3所示。较亮的斑点表示挥发性化合物的浓度较高。化合物的单体和二聚体由具有相同化合物名称的不同柱表示。部分风味物质未准确定性，以阿拉伯数字顺序编号。

A框为所有检测样品共有的挥发性有机化合物特征峰区域，共22种化合物，其中定性15种，主要为醛类和醇类化合物，包括己醛、(E)-2-己烯醛-M/D、2-甲基丁醛-M、戊醛、庚醛、5-甲基糠醛、己醇、苯乙醇、异丙醇、α-蒎烯-M。醛类化合物挥发性强，浓度高且阈值较低，是香椿中的重要的风味化合物。研究表明醛类物质一般是由脂质水解形成游离脂肪酸，然后饱和、不饱和脂肪酸经历热分解以形成氢过氧化物，并进一步反应形成[24]。这类化合物总体呈现脂香、果香、叶香、清香等。B框为河南地区样品信号强度显著高于其他地区的物质，有苯甲醛、糠醛、丁醛和3-甲基-2-丁醇等。C框为四川地区样品信号强度显著高于其他地区的物质，主要为酮类、酯类和醇类，2-丁酮-D、2,3-丁二酮、2-戊酮-M、2,3-戊二酮-D、3-羟基-2-丁酮、丙酸乙酯-M、乙酸乙酯-D、丙烯酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、(Z)-乙酸己烯酯，以及4-甲基-1-戊醇、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇。D框为贵州地区样品信号强度较高的物质有丙酸-D、乙酸乙酯-M、(E)-2-戊烯醛、异戊酸甲酯、二丙基硫醚、2-甲基丁醛-M。E框为湖北地区样品信号强度较高的物质2-丁酮-M、2-乙基-5-甲基吡嗪、三甲基噻唑、2-乙酰基-1-吡咯啉、柠檬烯、松油烯。F框为云南地区样品信号强度较高的物质有α-蒎烯-T、β-罗勒烯、(E,E)-2,4-七烯醛、菲兰烯等烯类物质。G框为山西安徽地区样品信号强度较高的物质有2,3-戊二酮-M、2-乙基呋喃、乙酸3-甲基丁酯、2-甲基丙酸、5-甲基-2-噻吩甲醛、正戊醇、α-蒎烯-D。表2中的定量结果也证实了这些分析。

2.4 不同产区香椿样品挥发性化合物的PCA

图3 不同产区香椿挥发性有机化合物指纹图谱Fig. 3 Fingerprints of volatile organic compounds of T. sinensis from different regions

PCA是一种多变量数据分析工具，用于分析带有定量变量的多维数据集[26]。通过确定几个PC因子代表原始样本中许多复杂且难以找到的变量，然后根据PC因子在不同样本中的贡献率评价样本之间的规律性和差异性[27]。它可以直观地显示不同样品之间的差异，样本距离越大，样本差异越明显。使用Dynamic PCA插件对不同产区的香椿挥发性化合物含量（信号峰体积）进行PCA，并对数据进行可视化，如图4所示。PC1、PC2、PC3的方差贡献率分别为41%、20%和10%，各样品之间存在一定的距离，根据PC1分值可以把8个香椿样品分为2 组，四川和云南地区香椿样品为一组，表明它们具有相似的挥发性化合物，这2个样品在气候条件方面也有相似的地理来源，均为亚热带季风气候，这可能有助于它们的挥发性化合物组成相似。其他6个产区香椿样品为一组，2 组样品距离比较远。

图4 不同产区香椿样品挥发性化合物的PCA图Fig. 4 PCA plots for discriminating volatile compounds of T. sinensis from different regions

2.5 不同产区香椿样品挥发性化合物的PLS-DA

PLS-DA与PCA一样是通过降维将复杂数据直观化，但PLS-DA是有监督的分析，属于模型的方法。有监督的PLS-DA有助于高维数据的可视化、判别分析与代谢变化有关的潜在代谢物。该方法可以先对所需的观察变量进行分组，后根据组别性质对数据进行统计分析，从而可以精确获悉影响分组的关键变量[28]。另外，在PLS-DA中使用交叉验证和置换检验可以评价模型的性能指标。R2为模型的拟合能力，Q2为对模型预测能力的估计，通过交叉验证进行计算，以大于0.5为宜，越接近1越好。以定性的66个化合物为x变量，以不同产区香椿为y变量，进行PLS-DA建立相关模型，模型的判别效果如图5所示，R2＝0.893 37，Q2＝0.789 18，说明该模型稳定性较好，未出现过拟合现象，具有较好的预测能力[29]，第1组为陕西、四川、云南的样点（第1象限和第2象限），第2组为山西、河南、湖北、安徽、贵州的样点（主要为第3象限以及第4象限）。

图5 PLS-DA计分图Fig. 5 PLS-DA score plots

为了进一步表征不同产地香椿样品挥发性化合物之间的差异，计算并检验了PLS-DA模型的VIP得分，采用“大于1”的标准，VIP值越大，说明在不同处理下该挥发性化合物的差异越显著[30]。共筛选出12种（VIP＞1）标志挥发性化合物如图6所示，其中VIP值大于4的(E)-2-己烯醛-D是最重要的区别因素，乙酸乙酯-D、苯酚、糠醛、苯乙醇等化合物VIP值大于2贡献最大，丙酸乙酯-D、2-甲基丁醛-M、三甲基噻唑、3-甲基-2-丁醇、2-戊酮-M、4-甲基-1-戊醇尤为重要。(E)-2-己烯醛-D含量最高的为贵州，其次是陕西和湖北；乙酸乙酯-D含量较高的为四川和云南；糠醛含量最高的为河南，而其他省份含量特别低。Wang Cheng等[31]采用GC-MS检测技术对新鲜香椿（陕西）和烫漂香椿样品中挥发性化合物进行分，通过OPLS-DA筛选出5种挥发性化合物的生物标志为2-己烯醛、3,4-二甲基噻吩、石竹烯、β-蛇床烯、γ-古芸烯。与本实验GC-IMS结果除了2-己烯醛外，均不相同。GC-IMS检测结果与GC-MS结果呈现出一定的差异性，可能在于GC-MS技术检测的多是大分子且含量较高的挥发性成分，且样品必须经过固相微萃取前处理和提取，而GC-IMS检测出的大多为小分子、挥发性强且含量低的挥发性成分，且检测时间短。故GC-IMS可以实现对不同产区香椿挥发性化合物的差异进行快速分析。

图6 VIP得分Fig. 6 VIP scores of volatile compounds

3 结 论

采用GC-IMS技术对8个产区香椿中挥发性化合物进行有效的分离、检测，共鉴定出56种化合物，包括11种醛类、8种醇类、8种酮类、4种含硫类和4种酸类、5种烯类、7种酯类以及主要由呋喃和吡嗪组成的9种其他类，醇类和醛类的相对含量较高，醇类占比均在30%以上，四川地区达39.93%。河南地区香椿样品苯甲醛、糠醛、丁醛和3-甲基-2-丁醇信号强度显著高于其他地区，是该地区的标志性物质。云南地区香椿样品α-蒎烯-T、β-罗勒烯、菲兰烯等烯类物质信号强度较高。贵州地区香椿样品丙酸-D、乙酸乙酯-M、(E)-2-戊烯醛、2-甲基丁醛-M、二丙基硫醚信号强度较高。山西和安徽地区香椿样品2,3-戊二酮-M、2-乙基呋喃、2-甲基丙酸、5-甲基-2-噻吩甲醛、正戊醇等信号强度较高。根据PCA可以把8个香椿样品分为2 组，四川和云南地区香椿样品为一组，其他6个产区香椿样品为一组，2 组样品距离比较远。利用PLS-DA对8个产区香椿挥发性化合物进行了判别分析，筛选出12种（VIP＞1）标志挥发性化合物，其中(E)-2-己烯醛-D、乙酸乙酯-D、苯酚、糠醛、苯乙醇是主要的差异物质。不同产区香椿挥发性化合物存在较大差异，但其影响机理还不清晰有待进一步研究。

采用GC-IMS将香椿挥发性有机化合物进行定性定量分析，构建指纹图谱，对比明显，可以直观看出各样品各成分之间差异。PCA与PLS-DA均是通过降维将复杂数据直观化，数据降维后所得综合变量在二维空间即可表达原有变量的绝大部分信息，可以对所需的观察变量进行分组，直观地观察到组间和组内样品间的差异性，另外有监督的PLS-DA可以精确判别影响分组的标志挥发性化合物，从而实现香椿样品区分和产地溯源。