黄 国，陈 骐，池云峰，罗小雪，衣艳娇，王 迪，隋晓楠

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

黑米作为我国一类有色稻米，因其良好的口感和香气而被广泛食用。黑米的“有色”归因于较高含量的花青素和原花青素。黑米中游离花青素对其总量的贡献率在99.5%～99.9%之间[1]。黑米中主要花青素有矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）和芍药色素-3-葡萄糖苷，前者的含量明显高于后者[2]。花青素被视为自然界的天然色素，具有预防、治疗心血管疾病、抗癌抗炎、调节神经系统以及良好的清除自由基能力，在食品与医疗、保健等领域的产品生产、开发中起到重要作用[3]。但由于易受pH值、温度、辐射与氧气等环境因素的影响，花青素在加工与贮藏过程中往往发生高度降解或破坏，导致其加工稳定性差，生物利用度低下，成为在食品工业应用中的最大阻碍[4]。因此，防止和控制花青素的降解将有助于提高花青素的稳定性和生物活性。

近年来，由于蛋白质优异的生物相容性和良好的功能特性，以蛋白质为载体的多酚稳定方式引起了众多学者的研究兴趣。蛋白质作为一种生物大分子，可以通过氢键、疏水相互作用等与多酚小分子发生结合进一步改善其稳定性[5]。花青素由于独特的多酚结构，已被证实是一种优良的蛋白亲和性小分子，可以与包括大豆蛋白在内的多种蛋白质结合[6]。一方面，多酚与蛋白质的结合可以影响蛋白质的结构与功能特性。You Yaohui等[7]报道了表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）诱导大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）的三级结构解折叠，暴露出更多的活性基团，从而提高起泡、乳化等功能特性。黑米花青素与SPI交联后，促使SPI的二级结构由β-折叠向β-转角和无规卷曲转变，其起泡和乳化性得到改善[8]。另一方面，蛋白质可以充当载体进而影响多酚的抗氧化能力及生理活性。Zang Zhihuan等[4]发现牛血清蛋白与乳清分离蛋白可以通过疏水相互作用和氢键与蓝莓花青素结合，其蛋白颗粒可以作为花青素的保护载体。Zou Yucong等[9]研究表明葡萄籽原花青素以静态猝灭的方式猝灭SPI的内源荧光，并通过以氢键为主导的作用力与SPI形成复合物，其抗氧化性与稳定性显著提高。水稻谷蛋白分子对接实验表明二聚原花青素能在蛋白质内腔保持稳定，从而提高原花青素的稳定性和抗氧化能力[10]。β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白作为大豆蛋白中最主要的2种储存蛋白，两者的构象、分子质量及功能特性上的差异已被众多学者所深究[11]。然而更多的集中于多酚对SPI结构及功能特性的影响，而对于β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白与多酚的相互作用鲜有研究。Wu Di等[12]研究表明β-伴大豆球蛋白对金丝桃苷的运载能力强于大豆球蛋白；并指出这可能是因为β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的分子质量和氨基酸残基数量的差异影响了金丝桃苷的运载效率。Ochnio等[13]发现叶酸能够通过疏水相互作用结合至大豆蛋白中并诱导其发生变化；与β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白能够被叶酸诱导成更加广泛的聚集体，有利于自组装以形成更高效的维生素运输载体，并使叶酸的装载能力高于β-伴大豆球蛋白。研究表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白与C3G的相互作用是由疏水相互作用和静电力共同驱动的，其相互作用改变了大豆蛋白的二、三级结构和表面活性并在一定程度上降低其热稳定性[14]。尽管该研究详细探究了两者的相互作用及对蛋白质功能特性的影响，然而缺少对多酚小分子稳定性等的探讨及两者在分子水平上相互作用的见解。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白因不同的结构特征、分子质量等特性可能会影响它们与花青素等多酚小分子的互作机制（如相互作用力差异），从而影响了多酚的稳定性和抗氧化活性。因此，从分子水平机制上了解β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白与C3G的相互作用的差异，对揭示β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白对C3G的稳定性和抗氧化活性的影响十分必要[8]。

因此，本实验在前人研究基础上以C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白为研究对象，借助多重光谱以及分子模拟对接等技术手段，揭示C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白之间的相互作用，深入分析C3G与大豆蛋白的互作机理与差异。该研究旨在分子水平上为花青素的保护提供见解，从而更深层次了解大豆蛋白对花青素等酚类物质的稳态化作用及生理活性特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米花青素由实验室自制[15]，以C3G含量为标准计花青素纯度为（95.05±0.92）%；低温脱脂豆粕 山东禹王实业有限公司；所用试剂均为分析纯，水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

ALPHA 1-4LSC冷冻干燥机 德国Christ公司；FTIR-8400S傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱仪 日本岛津公司；F-7100荧光光谱仪日本Hitachi公司；Chirascan圆二色谱（circular dichroism，CD）仪 英国应用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的制备

根据Nagano等[16]描述的方法稍作改动。将脱脂豆粕粉碎过100 目筛，得到脱脂大豆粉。将脱脂大豆粉分散溶解在10 倍体积的去离子水中。在室温下用2 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.5，在4 ℃，10 000×g离心30 min，弃沉淀物；取上清液加入固体无水亚硫酸氢钠（0.98 g/L）并用2 mol/L HCl溶液调节pH值至6.4，保持4 ℃过夜。在4 ℃、6 500×g离心20 min，所得沉淀为大豆球蛋白。其上清液中按照最终浓度为0.25 mol/L添加固体NaCl并用2 mol/L HCl溶液调节pH值至5.0，在4 ℃、10 000×g离心30 min，弃沉淀物。取上清液用等体积去离子水稀释，而后调节pH值至4.8，在4 ℃、6 500×g离心20 min，所得沉淀物即为β-伴大豆球蛋白。用去离子水水洗沉淀物β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白后再溶解，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.5，在3 500 Da透析袋中透析48 h后，冷冻干燥得到β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白粉末备用。经凯氏定氮法测定（N×6.25），分别得到基于干基蛋白质质量分数为（92.40±1.03）%、（97.25±0.92）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白。而后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分别得到纯度为（83.21±2.18）%、（92.65±1.73）%的β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白[8]。

1.3.2β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白-C3G溶液的制备

将β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白溶解于10 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）后，将C3G按比例分别溶于上述蛋白溶液中，在室温避光隔氧的条件下搅拌90 min分别制成β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白的C3G复合溶液。将未添加C3G的大豆蛋白溶液设置为空白对照，编号为0，添加C3G的溶液按照浓度梯度依次编号为1～10。

1.3.3 内源荧光光谱测定

按照1.3.2节的方法制备β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白最终质量浓度为0.05 mg/mL、C3G的最终浓度在0～45 μmol/L之间），置于荧光比色杯中后利用荧光光谱仪分别测定各样品的荧光光谱。其中，扫描发射波长在290～460 nm之间，激发波长为280 nm，激发和发射狭缝均设定为5 nm，扫描速率设定为1 200 nm/min，电压设定为600 V。

1.3.4 同步荧光光谱测定

按照1.3.3节方法（溶液的量与浓度均相同）室温条件下，激发和发射的波长差值分别为Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，进行同步荧光光谱扫描。

1.3.5 三维荧光光谱测定

按照1.3.2节方法制备β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液（β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的质量浓度均为10 mg/mL、C3G质量浓度分别为0、0.10 mg/mL）。在室温条件下，将样品稀释至200 倍后，记录样品三维荧光光谱。其中，激发波长范围200～350 nm，发射波长为200～500 nm，波长间隔均为5 nm，激发和发射狭缝均为5 nm，扫描速率为1 200 nm/min，电压设定为600 V。

1.3.6 FTIR光谱分析

将1.3.5节制备的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G样品冷冻干燥后，将样品粉末与溴化钾粉末质量比为1∶100的比例混合后利用模具进行压片，在分辨率为1 cm-1的条件下扫描32次，波数范围为4 000～400 cm-1条件下扫描红外光谱。

1.3.7 CD光谱分析

将1.3.5节制备的β-伴大豆球蛋白-C3G、大豆球蛋白-C3G溶液在远紫外区190～250 nm进行扫描，速率为60 nm/min，分辨率为0.2 nm，响应时间为0.25 s，狭缝宽度为1 nm。使用CD Pro软件对蛋白质二级结构的组成成分及相对含量进行拟合[17]。

1.3.8 分子对接

分子对接在结果分析前的全部操作均在AutoDockTools-1.5.6软件中进行。β-伴大豆球蛋白（PDB ID：1UIK）/大豆球蛋白（PDB ID：1OD5）的晶体结构取自Protein Data Bank蛋白质数据库，C3G（黑米花青素主要成分）的结构取自PubChem数据库。分别利用Autodock对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白与C3G进行去水与加全氢等预处理。由于缺乏对接位点的信息，采用盲对接的方式，建立可包含整个蛋白质的对接网格盒子。随后利用Lamarckian genetic algorithm算法对接50次，其他参数采取默认值，根据结合能大小对结果进行排序，借助Pymol、Discovery Studio 2019等软件对最低能量构象进一步分析。

1.4 数据统计与分析

每组数据均做平行重复实验3次，利用SPSS 17.0软件进行相关分析及ANOVA差异显著性分析，P＜0.05，差异显著。采用Origin 8.0、CD Pro、Pymol 2.3、Discovery Studio 2019等软件进行图表制作与CD光谱数据分析等操作。

2 结果与分析

2.1 内源荧光光谱分析

2.1.1 C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白内源荧光光谱的影响

荧光光谱已成为表征蛋白质与多酚相互作用后微环境变化的主要手段。蛋白质的内源荧光主要是在280 nm激发波长下，由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基所引起[18]。如图1所示，C3G的加入使蛋白的内源荧光强度降低，降低程度与C3G的添加量呈正相关，说明C3G可以猝灭β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的内源荧光，且具有浓度依赖性。另外，大豆球蛋白的荧光强度远大于β-伴大豆球蛋白，可能是由于大豆球蛋白具有更高含量的Trp和Tyr残基导致[19]，这与Ren Cong等[14]的研究结果一致。C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的猝灭效率分别为（62.14±1.06）%和（70.35±1.14）%，即C3G与大豆球蛋白的相互作用更强。

图1 C3G对β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）内源荧光光谱的影响Fig. 1 Effect of C3G on the intrinsic fluorescence spectra of β-conglycinin (A) and glycinin (B)

2.1.2 猝灭类型、表观结合常数及结合位点数

荧光猝灭根据形成机理不同可分为动态和静态猝灭机制。其中静态猝灭由猝灭剂和荧光团形成的复合物引起，随着温度的提高，复合物的稳定性下降，静态猝灭常数降低；而动态猝灭则由二者的碰撞引起，猝灭常数随温度的变化与静态猝灭相反[20]。依据Stern-Volmer方程进行计算，如式（1）所示：

式中：F0、F分别为未加入和加入猝灭剂时蛋白的荧光强度；Q为猝灭剂的浓度/（mol/L）；Ksv为动态猝灭常数/（L/mol）；Kq为双分子猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为无猝灭剂时荧光体的寿命，蛋白的平均寿命约为10-8s。

图2 不同温度下C3G猝灭β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白（B）的Stern-Volmer图Fig. 2 Stern-Volmer plots for quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) by C3G at different temperatures

图2和表1表明，随着温度的提高，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的Stern-Volmer方程线性斜率逐渐增大，说明存在动态猝灭。但C3G对β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的荧光猝灭速率（1012L/（mol·s）），远大于最大扩散碰撞猝灭常数（2×1010L/（mol·s）），表明猝灭方式中也存在静态猝灭[21]。此类动态与静态兼具的猝灭方式在多酚与蛋白质的相互作用中较为常见，如在麦醇溶蛋白与C3G[22]、β-酪蛋白与低聚原花青素[20]的研究中均有报道。

表1 不同温度下C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的荧光猝灭常数及其决定系数Table 1 Fluorescence quenching constants and determination coefficients for C3G binding to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

两者的表观结合常数及结合位点数使用双对数曲线方程计算，如式（2）所示：

式中：Ks为表观结合常数；n为结合位点数。

如图3和表2所示，一方面，C3G和β-伴大豆球蛋白之间的Ks值随着温度的升高而增加，这表明C3G-β-伴大豆球蛋白的形成是吸热反应，其稳定性随着温度的升高而增加；而大豆球蛋白则相反，表明升温不利于复合物的稳定[22]。另一方面，大豆球蛋白较β-伴大豆球蛋白具有更大的Ks值，并大于104数量级，说明C3G对大豆球蛋白的结合亲和力强于β-伴大豆球蛋白[23]。此外，2 组复合物的结合位点数n均接近于1，说明C3G与2种蛋白均形成了物质的量比约为1∶1的静态复合物[24]。

图3 不同温度下C3G猝灭β-伴大豆球蛋白（A）、大豆球蛋白结合（B）的双对数图Fig. 3 Double logarithmic plots for C3G quenching of β-conglycinin (A) and glycinin (B) at different temperatures

表2 不同温度下C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白相互作用的结合位点数、表观结合常数及其决定系数Table 2 Number of binding sites, apparent binding constants and determination coefficients for interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin at different temperatures

2.1.3 热力学参数及作用力类型

根据式（3）～（5）计算热力学参数：

式中：K为对应温度下的表观结合常数；R为理想气体常数8.314 J/（mol·K）；ΔG为吉布斯自由能/（kJ/mol）；ΔH为焓变/（kJ/mol）；ΔS为熵变/（J/（mol·K））。

利用热力学参数分析蛋白质与多酚互作中的主导作用力。当ΔH＞0、ΔS＞0时，为疏水相互作用；当ΔH＞0、ΔS＜0时，静电相互作用和疏水相互作用为主导；当ΔH＜0、ΔS＜0时，范德华力和氢键共同主导；ΔH＜0、ΔS＞0时，为静电作用力[25]。如表3所示，C3G与β-伴大豆球蛋白结合时，ΔG＜0、ΔH＞0、ΔS＞0，说明两者发生了吸热的自发结合，且疏水作用力是两者结合的主要结合力。作为在多酚与蛋白质互作中最常见的主导作用力，同样在EGCG与SPI的互作中起稳定复合物构象的关键作用[26]；而C3G与大豆球蛋白结合时，ΔG＜0、ΔH＜0、ΔS＜0，说明二者之间的相互作用是自发的放热反应，范德华力和氢键为两者结合的主要结合力，这与Tang Lin等[27]对C3G与肌红蛋白、血清蛋白和血红蛋白的互作情况所得到的结果一致。

表3 不同温度下C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters for the binding of C3G to β-conglycinin/glycinin at different temperatures

类似的，刘勤勤[28]和Zhou Yucong[9]等分别研究了SPI与茶多酚及SPI与原花青素的相互作用，均发现氢键为两者结合的主导作用力；大豆球蛋白作为大豆蛋白的主要成分，当与多酚相互作用时，在大豆蛋白整体上其氢键可能占据了主导作用。而β-伴大豆球蛋白作为含量仅次于大豆球蛋白的大豆蛋白，其分子表面具有许多的疏水性区域[12]，当单独与多酚相互作用时，疏水性区域可能有利于疏水作用的发生。这与You Yaohui等[7]对SPI与EGCG的相互作用研究结果一致。然而，在结合过程中，由于蛋白质、配体和溶剂分子之间的各种相互作用和能量交换，很难同时剖析其贡献，因此基于热力学分析只能确定主导作用力[29]。

尽管如此，应当指出维持多酚与蛋白质相互作用力不只有或仅有唯一作用力，两者之间的相互作用力受多种因素影响。Yang Yaxuan等[30]发现EGCG与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的热力学参数为ΔH＜0、ΔS＞0，即静电作用力为主要结合力；Lan Tian等[31]通过溶剂组合发现了大豆蛋白肽与EGCG主要通过3种相互作用力稳定，疏水相互作用最为重要，其次是氢键，最后是二硫键；陈爽等[32]在VD3与SPI互作研究中发现SPI-VD3复合物的稳定性主要由静电作用力与疏水作用力共同维持。以上研究结果说明这可能是由不同的配体结构导致配体分子疏水/亲水性质的差异以及配体与蛋白质氨基酸残基间的相互作用差异所导致[33]。因此，大豆蛋白与多酚的结构复杂，未来应结合多种分析技术进一步详细分析两者之间的相互作用。

2.2 同步荧光光谱分析

图4 C3G与β-伴大豆球蛋白（A、B）、大豆球蛋白（C、D）结合的同步荧光光谱Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin (A, B) and glycinin (C, D)

同步荧光已选择性地应用于研究蛋白质的构象，特别是荧光团微环境的变化。同步荧光光谱最大吸收峰所对应波长的偏移可以反映蛋白氨基酸残基所在微环境极性的变化。当波长间隔为Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm时，分别表示Tyr残基和Trp残基的特征荧光信息[14]。如图4所示，Trp残基的荧光强度明显大于Tyr残基，表明Trp残基是蛋白荧光的主要贡献者。随着C3G浓度的增加，Trp残基的荧光猝灭程度远强于Tyr残基，这可能表明Trp残基比Tyr残基对蛋白质荧光的猝灭贡献更大[34]。对于Tyr残基，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的最大吸收波长变化均不明显，表明C3G对大豆蛋白的Tyr残基微环境的影响较小。对于Trp残基，大豆球蛋白最大吸收波长变化不明显，而β-伴大豆球蛋白的最大吸收波长产生轻微的红移；这暗示C3G可能诱导β-伴大豆球蛋白的Trp残基微环境向亲水环境转变，且与Tyr残基相比，结合位点可能更靠近Trp残基[7]。而对大豆球蛋白Trp残基微环境无明显影响。类似的，Cheng Jing等[35]实验观察到C3G使β-乳球蛋白的Tyr残基的最大吸收波长发生轻微红移，而Trp残基无明显变化。这表明Tyr残基周围亲水性增强，而Trp残基微环境无显著改变；并推测C3G结合位点可能更靠近Tyr残基。

2.3 三维荧光光谱分析

图5 C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的三维荧光光谱Fig. 5 Three-dimensional fluorescence spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

如图5所示，峰1（λEm＝340 nm，λEx＝280 nm）、峰2（λEm＝350 nm，λEx＝230 nm）、峰a（λEm＝λEx）和峰b（λEm＝2λEx）分别对应于Trp和Tyr残基的荧光特征峰、多肽链骨架结构的特征峰、瑞利散射和拉曼散射的特征峰[36]。β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的拉曼散射峰都有所降低，表明C3G-大豆蛋白复合物的形成并降低了光散射作用[37]；C3G的添加猝灭了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白峰1的荧光强度，表明大豆蛋白部分Trp、Tyr残基与C3G发生强烈的相互作用[8]。此外，峰2的荧光强度也有所降低，这表明β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白多肽链的展开和解折叠[38]。上述现象与Jiang Lianzhou等[15]的实验结果一致，即表明C3G诱导大豆蛋白多肽链发生解折叠，并表示由于蛋白质部分或完全的展开，促使部分Trp等残基暴露于亲水性环境中，进而表现出荧光强度的降低。

2.4 FTIR光谱分析

图6 C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的FTIR光谱Fig. 6 FTIR spectra of C3G binding to β-conglycinin/glycinin

利用FTIR光谱研究C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子间的相互作用及二级结构变化，其中蛋白质二级结构的变化情况主要由酰胺I带（反映C＝O伸缩振动）、II带（反映C—N伸缩振动与N—H弯曲振动）吸收峰的变化反映[21]。如图6所示，C3G的加入使β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的酰胺A带（反映N—H的伸缩振动）、酰胺I带和酰胺II带的峰值下降及峰位均发生红移或蓝移；这意味着氢键和疏水相互作用参与C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白结合的过程[39]，并可能引起了蛋白质二级结构发生变化[30]。该现象可能是由于C3G的羟基和大豆蛋白中—OH或C＝O氢键供体/受体基团之间发生非共价作用[40]。此外，大豆蛋白还可以与C3G中的芳香环之间形成疏水相互作用。因此，大豆蛋白和C3G之间的氢键与疏水相互作用，可能被认为是促进两者结合的主要作用力；并进一步影响了蛋白质的二级结构的变化[22]。Chen Zhongqin等[21]指出，C3G可能与蛋白质的疏水腔结合，导致多肽链中氢键网络的重新排列和相关蛋白质的二级结构的改变。

2.5 CD光谱分析

图7 β-伴大豆球蛋白-C3G（A）与大豆球蛋白-C3G（B）复合物的CD光谱Fig. 7 CD spectra of β-conglycinin-C3G (A) and glycinin-C3G (B)complexes

如图7和表4所示，C3G的加入使大豆蛋白二级结构产生微小变化，即α-螺旋相对含量降低，β-折叠相对含量提高；而β-转角和无规卷曲相对含量则无明显变化。这暗示C3G可能结合到大豆蛋白α-螺旋结构的疏水区域，诱导其向β-折叠转变，使肽链轻微解折叠[41]。朱颖等[17]通过CD光谱发现，黑米花青素诱导SPI中α-螺旋部分转变为β-折叠，即黑米花青素对SPI和具体组分二级结构相对含量的影响结果一致。这可能由于C3G结合至蛋白质的疏水区域中，并诱导多肽链二级结构单元间氢键发生重排，导致α-螺旋含量的下降及β-折叠含量的上升，从而产生了更稳定的构象[21,42]。稳定的构象可能会对C3G的稳态化起到良好作用，正如Attaribo等[43]和Chen Zhongqin等[21]的研究结果表明：与C3G混合后，蛋白质α-螺旋含量降低和β-折叠含量增加可以提高C3G的稳定性。因此，β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能有望成为保护、递送C3G的优良载体。

表4 β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白的二级结构相对含量变化Table 4 Changes in relative contents of secondary structures in β-conglycinin/glycinin

2.6 分子对接分析

表5 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作能量细则Table 5 Energy requirements associated with interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

选取黑米花青素中含量最高的C3G为模型多酚，进行分子对接。随后从50种对接结果中选出结合能前5的对接姿态进行展示（表5），并遵循最小能量原则选出最优结果（图8），进行对接细节分析。从Autodock对接结果中可以提取出结合能（ΔG）、分子间作用力能量（Eintermol）、范德华力能量+氢键能量+疏水作用力能量总和（Evhd）、静电相互作用能量（Eelec），其中Eintermol＝Evhd+Eelec。从结合能而言，ΔG的数值表明C3G均自发与两种蛋白结合，且与大豆球蛋白的结合程度更大，在大豆球蛋白-C3G体系中表明该复合物更稳定[44]。该结果表明，与β-伴大豆球蛋白相比，大豆球蛋白-C3G体系的组合降低了生物体内小分子的利用度。小分子的生理活性及其在体内的功能与载体蛋白的亲和力有关，因此推测大豆球蛋白对C3G的运输能力可能要比β-伴大豆球蛋白强。在Wu Di等[12]研究中也发现了类似的现象：与大豆球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白对金丝桃苷具有更好的递送性能。此外，在所有分子间作用力中以Evhd为主，表明范德华力、氢键和疏水作用力是两者结合过程中的主要作用力；静电作用力数值极小，表明其不是主要作用力，但对维持构象稳定有一定的贡献[27]。

图8 C3G-β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白互作3D、局部、2D图Fig. 8 Three-dimensional and two-dimensional illustration of interaction between C3G and β-conglycinin/glycinin

图8B和C表明β-伴大豆球蛋白共有7个氨基酸残基参与了C3G的结合。其中疏水性氨基酸Asp-934、Ile-921、Lys-951和Arg-933的疏水部分与C3G距离较近，形成4个疏水相互作用，从而减少了水的介入，有助于C3G与β-伴大豆球蛋白形成稳定的复合物；Arg-918、Asp-934、Thr-948、Glu-950、Lys-951与C3G共形成10个氢键。与疏水相互作用类似，这些氢键也加强了非共价作用的强度，使二者结合更加稳固；此外，C3G中的二羟基苯环与Lys-951带正电的氨基形成π-阳离子作用力。

图8E和F显示大豆球蛋白共有6个氨基酸残基参与了C3G的结合。其中Arg-522、Val-523和Glu-533参与形成疏水相互作用；Arg-522、Val-523、Asp-531、Glu-533、Thr-537、Gly-542参与形成氢键，C3G的二羟基苯环与Arg-522具有正电性的胍基形成π-阳离子作用力。因此，在C3G与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白分子对接过程中，疏水作用力起重要作用。并且，由于C3G是一种被广泛认同的良好氢供体，其与蛋白质基团形成的氢键对维持复合物稳定性也起决定性作用。此外，还兼具π-阳离子结合力的作用。不仅如此，大豆蛋白与C3G的芳香环结合，大部分酚羟基参与成键；因此β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白可能对C3G形成保护，进而提升C3G的稳定性[45]。玉米醇溶蛋白以相似的模式与EGCG结合，其已被证实可成为有效的茶多酚递送系统[46]。然而，由于C3G的B环上酚羟基全部参与成键，因此在一定程度上导致其抗氧化能力下降，这可能与蛋白质的屏蔽作用有关[47]。

3 结 论

通过多重光谱技术及分子对接等手段研究了β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白与C3G的相互作用，主要结论如下：1）C3G可以通过静态和动态兼具的猝灭方式猝灭的大豆蛋白内源荧光。C3G主要通过范德华力、氢键或疏水作用分别与β-伴大豆球蛋白/大豆球蛋白形成复合物；2）C3G可以结合至大豆蛋白的疏水空腔中，依靠多种作用力共同维持复合物的稳定性；C3G诱导部分蛋白质二级结构α-螺旋向β-折叠转变，多肽链发生解折叠。此外，还引起了β-伴大豆球蛋白的Try残基微环境的变化；3）C3G与大豆球蛋白的亲和力强于β-伴大豆球蛋白。C3G与大豆蛋白的结合可能有利于C3G的递送，但一定程度上减弱C3G的利用度和生理活性。