何 颖，吕东霖，廖国周，贾 蓉，葛长荣，黄 明，王桂瑛,*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南 昆明 650201；3.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

味道是决定食物可接受性的重要因素，其中鲜味作为5大基本味道之一，于1908年首次提出[1]。鲜味是游离氨基酸类、核苷酸类、肽类、有机酸及其衍生物等物质与鲜味受体结合而产生的，这些鲜味物质可以改善食品的总体味感[2-3]。鲜味肽是一类分子质量范围在300～3 000 Da的肽[4]。最早从木瓜蛋白酶处理的牛肉中发现了鲜味六肽[5]，此后在多种食品中均鉴定出鲜味肽，如动物性食品中的猪肉[6]、鸡汤[7]、鱼肉[8]等，植物性食品中的花生[9]等，真菌界的远东疣柄牛肝菌[10]等，以及发酵食品中的酱油[11]、白腐乳[12]等。此外，温志鹏[13]发现海带中的鲜味肽具有一定的抗氧化能力。由于鲜味肽独特的呈味特性和生物学功能，人们对于食物中鲜味肽的发掘和表征越来越感兴趣。

武定鸡是云南省极具代表性的鸡种之一[14]，位居“云南六大名鸡”之首，主产于楚雄彝族自治州武定县，具有体大、肉嫩、味鲜等特点，深受群众喜爱[15]。目前有关武定鸡的研究主要在品质性状和风味物质上，朱仁俊等[16]对武定鸡肉品质进行了研究，结果表明阉割处理可以使武定鸡肉质更细嫩；本课题组前期已对武定鸡肉中的风味前体物及加工过程中形成的特征风味物质开展研究[17]；Yu Yuanrui等[18]研究了天然香料对武定鸡风味前体物质和挥发性风味物质的影响；Xiao Zhichao等[19]对武定鸡的代谢产物进行了研究，发现有机酸和小分子肽是鸡胸肉和鸡腿肉的主要代谢产物。然而，对于武定鸡肉中的鲜味肽仍未深入发掘。

本研究采用超滤分级、凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）及反相高效液相色谱（reversedphase high performance liquid chromatography，RPHPLC）对武定鸡的鲜味成分进行分离与纯化，结合感官评价确定鲜味最强烈的组分，以纳升高效液相色谱-串联质谱（nanoscale high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）联用技术测定肽的分子质量和氨基酸序列，并对鉴定的多肽进行合成，进一步研究其呈味特性。本研究为完善武定鸡的特征风味体系和深入研究鲜味肽呈鲜机制奠定基础，也为武定鸡的精深加工及鲜味肽类调味品的开发提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

140 日龄的雌性武定鸡由云南农业大学实验鸡场提供。

葡聚糖凝胶G-15 上海索莱宝生物科技有限公司；柠檬酸、蔗糖、氯化钠、奎宁、味精 昆明赛捷生物科技有限公司；95%乙醇溶液 天津市风船化学试剂科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈 德国Merck公司；所有感官用试剂均为食品级，所有分离用有机溶剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；BS224S电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；Milli-Q Gradient超纯水系统 上海熙扬仪器有限公司；TGL-16K冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器有限公司；SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；MSC超滤杯 上海摩速科学器材有限公司；79-1磁力搅拌器 天津市滨海新区大港红杉实验设备厂；HWS24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；普通玻璃层析柱 上海沪西分析仪器厂；752型紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；HL-2恒流泵、BS-100A自动馏分收集器 上海青浦沪西仪器厂；1200型高效液相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；Nano-HPLC-MS/MS仪 美国赛默飞世尔科技公司；ZipTip C18除盐柱 美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 武定鸡肉水提物（chicken water extract，CWE）的制备

参考Zhang Meixiu等[20]的方法并略有改动。取200 g鸡胸肉切碎，在10 000 r/min经高速分散器均质30 s处理3次，加入800 mL超纯水后得到匀浆，将其在50 ℃水浴搅拌3 h提取肽，得到肽粗提液。将肽粗提液在4 ℃、10 000 r/min离心15 min后取上清液。重复提取3次，合并上清液，即得到富含鲜味肽的呈味基料（CWE）。

1.3.2 CWE的超滤分级

一般食源性蛋白中呈味肽的分子质量均小于5 000 Da[21]。本实验选用1 000、3 000 Da及5 000 Da的超滤膜对CWE在4 ℃进行超滤分级：首先将样品通过5 000 Da的超滤膜，随后将透过液分别透过3 000 Da和1 000 Da的超滤膜，分级后得到3个组分，分别命名为CWE-I（分子质量＜1 000 Da），CWE-II（1 000 Da＜分子质量＜3 000 Da），CWE-III（3 000 Da＜分子质量＜5 000 Da），浓缩后冷冻干燥成粉末，用于感官评价，收集鲜味最强烈的组分用于下一步分离纯化。

1.3.3 CWE超滤组分的GFC分离

选择葡聚糖凝胶G-15作为柱填料，称取60 g葡聚糖凝胶干粉浸泡于400 mL超纯水中至少24 h，不断搅拌使凝胶充分溶胀。平衡后去除多余的颗粒和悬浮液进行装柱（1.6 cm×80 cm），待稳定后便可上样。

将上述鲜味最佳的超滤组分冻干粉加超纯水配制成25 mg/mL的溶液，经0.45 μm水相滤膜过滤后，以凝胶层析柱进行分离纯化。以超纯水为流动相，流速为0.8 mL/min，上样量为1 mL，紫外检测波长为220 nm。样品经GFC分离后得到不同的分离组分，用自动馏分收集器收集并冻干备用。通过对分离组分进行感官评价，筛选出鲜味感官分数最强烈的组分用于后续纯化。

1.3.4 GFC分离组分的RP-HPLC分离纯化

将GFC分离得到的鲜味较强的肽组分冻干粉与蒸馏水配成质量浓度为10 mg/mL的溶液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液进入RP-HPLC系统进一步分离纯化得到不同的分离组分，收集并合并各组分，经真空浓缩、冷冻干燥后，贮藏在-20 ℃。对各冻干组分进行感官评价分析，对鲜味得分最高的组分进行结构鉴定。

分离条件：Thermo GOLD C18色谱柱（4.6 mm×250 mm）；流动相A：含0.05% TFA的乙腈溶液；流动相B：含0.05% TFA的超纯水；等度洗脱程序：5% A+95% B，25 ℃洗脱20 min，流速0.8 mL/min。检测波长220 nm，进样量10 μL。

1.3.5 RP-HPLC分离纯化组分的Nano-HPLC-MS/MS鉴定

以Nano-HPLC-MS/MS分析鲜味得分最高的RP-HPLC分离纯化组分的分子质量和氨基酸序列。上样前取适量样本采用ZipTip C18除盐柱（10 μL）进行除盐，共上样3 μL样品。

色谱条件：Acclaim PepMap C18色谱柱（75 μm×25 cm）；柱流量300 nL/min；柱温40 ℃；电喷雾电压2 kV；流动相A：含0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～3 min，98%～94% A、2%～6% B；3～42 min，94%～80% A、6%～20% B；42～47 min，80%～65% A、20%～35% B；47～48 min，65%～0% A、35%～100% B；48～60 min，0% A、100% B。

质谱仪在数据依赖采集模式下运行，在MS和MS/MS采集间自动切换。质谱条件：MS：扫描范围m/z200～1 500；分辨率70 000；自动增益控制目标3×10-6；最大注入时间60 ms；扫描电荷2～6。高能碰撞解离MS/MS：分辨率1 7500；隔离窗口m/z2；自动增益控制目标5×10-4；最大注入时间50 ms；碰撞能量27 eV，动态排除时间20 s。

串联质谱图经过PEAKS Studio X+软件分析，使用PEAKS DB算法对Uniprot-Gallus数据库（版本201907，18 124 条目）搜库，设置None酶解。碎片离子质量容许误差0.02 Da，母离子质量容许误差7×10-6；最大漏切数为2；可变修饰：氧化修饰15.99，脱酰胺化0.98。蛋白卡值为-10 lgP≥0，至少含1个特异性肽段；肽段卡值为-10 lgP≥15。

1.3.6 多肽的合成及活性预测

采用固相合成法对鉴定的已知结构的肽段进行合成，脱盐处理后使其纯度在95%以上，委托上海吉尔生化有限公司合成，并通过BIOPEP呈味肽和氨基酸数据库预测所鉴定肽的潜在生物活性。

1.3.7 感官评价分析

1.3.7.1 感官评价小组培训

感官培训参考Liu Ziyuan等[22]的方法并有少许改动。共招募10 名成员（4 名男性和6 名女性，年龄为20～28 岁），所有小组成员均健康、不吸烟、无味觉和嗅觉障碍，在感官评价方面都有一定的经验，并知情同意参加本研究的感官测试。酸味、甜味、苦味、鲜味和咸味的参考标准分别为柠檬酸、蔗糖、奎宁、谷氨酸钠、氯化钠。感官评价小组经训练后记住以下标准物质的味道[23-24]：5 mmol/L 柠檬酸、10 mmol/L蔗糖、1 mmol/L奎宁、10 mmol/L谷氨酸钠和12 mmol/L氯化钠，所有感官实验均在（23±2） ℃的环境下进行。

1.3.7.2 CWE及其超滤组分的感官评价

将CWE以及超滤分离后各冻干组分溶于超纯水中，得到质量浓度为5 mg/mL的溶液进行感官评价。小组成员根据标准物质味道对实验样品（约1 mL）的味道进行评分，酸、甜、苦、鲜和咸的强度均为0～7 分，评价标准如表1所示[25]。在鲜味评分中，将超纯水的鲜味值定为0 分，1 mg/mL和2 mg/mL谷氨酸钠溶液分别定为4 分和7 分。

表1 感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.7.3 GFC分离组分的感官评价

参照Frank等[26]的滋味稀释分析法并略有改动。将超滤组分和GFC各分离组分用超纯水配成5 mg/mL的溶液，按体积比1∶1逐步稀释，每次取5 mL逐步稀释的样液，按质量浓度递减的顺序递给感官评价者，每个样品品尝约5 s。当某一稀释水平的溶液与两个空白（超纯水）之间的味道差异刚好能被分辨出来，此时稀释倍数即稀释因子。对评估人员的评价结果进行记录，评价过程不允许讨论和交流，结果为3次重复实验的平均值。同时，感官评价员还对各组分的味觉特征进行了描述。

1.3.7.4 RP-HPLC分离组分的感官评价

参照1.3.7.2节的方法对各RP-HPLC分离组分的鲜味进行感官评价。

1.3.7.5 合成肽的鲜味阈值测定和感官描述

合成肽鲜味阈值测定采用三角试验法[27]：将合成肽溶解在超纯水中配制为1 mg/mL溶液，以1∶1（V/V）逐渐稀释，直至溶液鲜味无法识别出为止。将倒数第2个溶液的质量浓度记为合成肽的鲜味阈值，同时，感官评价员评价了合成肽溶液的感官特性，包括酸、甜、苦、鲜和咸味。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 18.0软件处理数据并进行单因素方差分析（P＜0.05，差异显著），并使用Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 CWE的超滤分级与感官分析

如图1所示，随着CWE的逐步超滤分级，分离组分的鲜味逐渐增强；与CWE-II和CWE-III相比，CWE-I表现出较强的鲜味强度（P＜0.05），而咸味强度稍高但无差异显著性（P＞0.05）；并且CWE-I和CWE具有相似的整体风味轮廓，即组分CWE-I的鲜味评分最高，也就是说低分子质量组分CWE-I是关键的风味活性组分[28]，并具有较强的鲜味[29-30]。这些结果与之前的研究高度一致，Su Guowan等[9]将花生粕酶解液超滤后发现，低于1 000 Da的组分鲜味较强烈，而1 000～3 000 Da的组分有较好的鲜味增强效果；另外，丁奇[7]的研究结果表明无论是鸡汤还是酶解液中，均是分子质量小于1 000 Da的组分具有更强的鲜味。因此，收集鲜味最强烈的是CWE-I组分，使用GFC进行下一步的分离纯化。

图1 CWE超滤组分的感官雷达图Fig. 1 Radar map of sensory evaluation of CWE and its ultrafiltration fraction

2.2 CWE超滤组分的GFC分离与感官分析

CWE经过超滤后，虽然去除了比较多的大分子物质，但仍是复杂的混合肽样品，为了找出鲜味最强烈的武定鸡肉蛋白肽的分子质量范围，使用GFC对鲜味最强的超滤组分CWE-I进行进一步分离纯化。由图2可知，CWE-I组分经过GFC分离后得到了4个组分（F1、F2、F3、F4）。如表2所示，CWE-I，F1和F2组分的滋味以鲜味为主，咸、甜次之。由于鲜味、咸和甜的相互作用，咸和甜可以增强鲜味[31]，且鲜味物质含量高的组分也有较高的甜味物质含量[32,22]。此外，F2组分表现出仅次于超滤组分CWE-I的鲜味强度，稀释因子为64；并且随着组分不断分离，F3和F4组分的咸味有所降低，从侧面反映出凝胶过滤有一个较好的脱盐效果。根据感官评价结果，将F2组分用于后续的分离纯化。

图2 武定鸡肉超滤组分CWE-I的GFC图Fig. 2 GFC chromatogram of ultrafiltration fraction CWE-I

表2 超滤组分CWE-I和GFC分离组分的感官评价Table 2 Sensory evaluation of CWE-I and subfractions from it separated by GFC

2.3 GFC分离组分的RP-HPLC分离纯化与感官分析

收集GFC分离的鲜味最强烈的F2组分进行RP-HPLC分离纯化。如图3所示，在3～6 min保留时间内，F2分离后得到了4个在220 nm波长处有明显吸收的组分，将这些组分分别命名为F2-1、F2-2、F2-3、F2-4。极性强（疏水性弱）的物质先被洗脱出来，所以武定鸡中的鲜味肽极性都很强。研究表明，疏水性强弱与氨基酸性质有关[33]，多数的苦味氨基酸如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸为疏水性氨基酸，多数的甜鲜味氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸为亲水性氨基酸[34]，这代表组分中可能会含有亲水性的甜鲜氨基酸。如图4所示，F2-3的鲜味得分显著高于F2-1、F2-2和F2-4（P＜0.05）。因此，鲜味最佳的组分为F2-3，其鲜味强度是未经RP-HPLC分离纯化的F2的1.14 倍，故选择F2-3组分进行结构鉴定，测定肽的氨基酸序列组成。

图3 武定鸡肉GFC分离组分F2的RP-HPLC图Fig. 3 RP-HPLC chromatogram for F2 fractionation

图4 武定鸡肉GFC分离组分F2及其RP-HPLC分离纯化组分的鲜味强度Fig. 4 Umami intensity of F2 and its subfractions obtained by RP-HPLC

2.4 RP-HPLC分离纯化组分的Nano-HPLC-MS/MS结构鉴定

采用Nano-HPLC-MS/MS对RP-HPLC分离纯化的鲜味最佳F2-3组分中鲜味肽的氨基酸序列和分子质量进行分析。由表3可知，通过质谱鉴定出8种主要肽段，包括2 条三肽、1 条九肽、1 条十肽、1 条十一肽、1 条十二肽、1 条十三肽和1 条十五肽，这些肽段的分子质量范围为365.20～1 735.92 Da。

表3 武定鸡肉RP-HPLC分离纯化组分F2-3中鉴定的特征肽段Table 3 Signature peptide sequences identified in F2-3

2.5 武定鸡肉中鲜味肽的活性预测及呈味特性

为了研究多肽的呈味特性与氨基酸的组成之间的关系，采用生物活性肽数据库BIOPEP建立蛋白质片段的潜在感觉轮廓[35]。已鉴定的肽段通过BIOPEP数据库得到的感官活性预测结果如表4所示。该结果由A＝a/N计算所得（a为目标肽序列中具有特定味觉活性片段的片段数；N为肽段中含有的氨基酸残基数）。

表4 生物活性片段在鉴定肽中的出现频率Table 4 Frequency of occurrence of bioactive fragments in identified peptides

由表4可知，鲜味活性片段出现频率最高的肽段是LDF，其具有的鲜味片段为D，其次是FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL（包含D、DA和DD的鲜味活性片段），出现频率最低的是RKGFPSRIL，Toda等[36]报道天冬氨酸等鲜味氨基酸可以激活味觉受体T1R1/T1R3，所以LDF很有可能呈现鲜味。苦味活性片段出现频率最高的肽段是LLLYVRIYLVLR，其次是LLYVRIYLVLR、RKGFPSRIL、LYVRIYLVLR，最低的是FAGDDAPRAVFPS。对目前已报道的鲜味肽进行分析，发现一些具有苦味的氨基酸如组氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸等均是鲜味肽的组成成分[37]。酸味活性片段出现频率最高的肽段是LDF，其次是DLAGRDLTDYLMKIL，酸性氨基酸被认为是重要的鲜味刺激物质，它们通常包含在鲜味肽的氨基酸序列中[10]。丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸等甜味氨基酸也有助于鲜味[38]，甜味活性片段出现频率较高的肽段有FAGDDAPRAVFPS、FVT和RKGFPSRIL。因此，不能直接判断所鉴定肽的味觉活性，也不能仅凭味觉活性片段在所鉴定肽中出现的频率判断，综合以上分析推测LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鲜味。

表5 合成肽水溶液的滋味特性Table 5 Taste characteristics of synthetic peptides in aqueous solution

为了更全面地研究肽的滋味特性，采用固相合成法对上述所有已鉴定的多肽进行合成，对纯度大于95%的肽进行了味道描述和阈值分析。如表5所示，LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL这3 条肽具有明显鲜味，鲜味阈值分别为0.250、0.062、0.125 mg/mL。之前通过生物活性肽数据库BIOPEP预测LDF、FAGDDAPRAVFPS和DLAGRDLTDYLMKIL可能具有鲜味，但感官结果却显示FAGDDAPRAVFPS不具有鲜味，其原因可能是空间结构的差异，具体还需要进一步研究。莫加利等[39]从风干武昌鱼中分离出一条鲜味肽P2a-2，发现其二级结构以β-转角为主，相对含量高达90.16%，推测肽的鲜味与β-转角有关。RKGFPSRIL苦味强烈的原因可能是因为苦味氨基酸比例高或者是N端是碱性氨基酸（精氨酸）。Dang Yali等[40]的研究表明，精氨酸残基对肽和受体相互作用的活性位点有非常重要的影响。Liang Jiaming等[10]发现合成肽YNEYPPLGR具有强烈的鲜味很可能是因为C端含有精氨酸残基，Tamura等[41]研究碱性和酸性氨基酸的位置对呈鲜效果的影响时，发现肽的N端为带负电的酸性氨基酸，C端为带正电的碱性氨基酸时，二肽才有呈味特性，反之则没有呈味效果。LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、LLLYVRIYLVLR这3 条肽，它们没有鲜味和苦味，可能是不同感官特性氨基酸之间相互影响的结果。然而，FVT含有苯丙氨酸和缬氨酸两个疏水性氨基酸但仍呈现鲜味。之前有研究表明，疏水性氨基酸也可能会影响鲜味肽的呈味效果：如从鱼露中鉴定的鲜味肽MEREQEESTMR和LLDAFFFDNK，它们的氨基酸序列中含有呈苦味的甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等疏水氨基酸，但是总体仍呈现鲜味[42]。可见，鲜味肽的呈味效果与肽链长度、氨基酸的组成和排列顺序以及空间结构密切相关。

综上，肽的呈味特性受到很多因素的影响，将生物活性肽数据库BIOPEP的预测结果和感官分析结果相结合，有助于更全面地研究多肽的呈味效果与其结构之间的关系。

3 结 论

CWE经过超滤分级、GFC及RP-HPLC分离纯化并结合感官评价得到具有较强鲜味的组分F2-3，经Nano-HPLC-MS/MS鉴定出8 条多肽，分子质量范围为365.20～1 735.92 Da，氨基酸序列分别为RKGFPSRIL、LDF、FAGDDAPRAVFPS、FVT、LYVRIYLVLR、LLYVRIYLVLR、DLAGRDLTDYLMKIL和LLLYVRIYLVLR。采用BIOPEP数据库对其感官活性进行预测，并通过固相合成确定其味道特征，发现LDF、FVT和DLAGRDLTDYLMKIL这3 条肽具有鲜味。本研究丰富了武定鸡的风味体系，为进一步阐明武定鸡肉中鲜味肽的构效关系提供参考。