王佼佼， 田茂松， 王明进， 王娜， 廖玉丹， 刘玲， 潘雪莉

(贵州医科大学 公共卫生与健康学院 & 环境污染与疾病监控教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

马拉色菌(Malassezia)是一种条件致病真菌[1]，寄生于人和动物的正常皮肤表面，在机体免疫力下降或皮肤微环境失调(温度、湿度、皮肤油脂分泌情况、多汗等)的情况下，可致皮肤发生马拉色菌毛囊炎、花斑糠疹等炎症，也与脂溢性皮炎、特异性皮炎、银屑病等的发生发展有关[2-4]。马拉色菌毛囊炎是一种临床常见的炎症性、浅表性皮肤病，可呈慢性表现，皮损以鳞屑、红斑为主，并且伴有不同程度瘙痒，引起该病的菌种主要为糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur,M．furfur)。临床上治疗马拉色菌相关皮肤病主要为外用抗真菌药物，长期使用会导致使用局部皮肤萎缩、毛细血管扩张、痤疮样皮炎、色素沉着及继发感染，疗效虽好但副作用多，且不能长期使用。所以针对此类微生物的感染，探索新的治疗方法具有重要意义。小叶苦丁茶，系采摘木犀科粗壮女贞(ligustrum purpurascens)的幼嫩芽叶经加工而成。小叶苦丁茶因其独特的味道在我国具有悠久的饮用历史，还具有一定的药用背景[5-6]。有研究发现苦丁茶水提取物中的成分槲皮素、多糖类、黄酮、皂苷有明显的抗菌抑菌作用[7-9]。在对皮肤病治疗中，利用苦丁茶煎剂熏洗湿敷治疗足癣合并细菌感染临床疗效良好[10]，苦丁茶液对放疗所致口腔溃疡的恢复也有良好的促进作用[11]。目前未见应用小叶苦丁茶治疗马拉色菌皮肤感染的相关研究报道，故本研究通过建立M．furfur皮肤感染豚鼠模型，观察小叶苦丁茶水煎液外涂对豚鼠M．furfur皮肤感染恢复的促进效果，为探索M．furfur皮肤感染安全有效的治疗方法提供新的思路，并进一步挖掘苦丁茶“食药两用”的应用价值与前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康白色豚鼠20只，体质量为(325±10)g，雌雄各半，由本校实验中心提供[许可证号SCXK(湘)2019-0015]，所有豚鼠均单独饲养。本研究方案已通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审核并批准(批准号为1900227)。

1.1.2实验菌株 糠秕马拉色菌标准菌株(广东省微生物研究所，编号ATCC 44344)。

1.1.3实验材料 小叶苦丁茶购于贵州省余庆县，豚鼠高脂饲料购于江苏协同医药生物工程有限责任公司。

1.1.4实验仪器与试剂 正置荧光显微镜(日本Nikon公司)，T100梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)，真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(宝生物工程有限公司)，4%多聚甲醛。

1.2 实验方法

1.2.1M．furfur菌悬液配制 将M．furfur接种于固体培养基中，传代培养2次后，挑其菌落置于0.9%生理盐水无菌试管中，震荡摇匀制成菌悬液，麦氏比浊管计数将浓度调整为1×109CFU/mL。

1.2.2M．furfur皮肤感染豚鼠模型 20只豚鼠按体重随机分为模型组(14只)和对照组(6只)，组内雌雄各半。将每只豚鼠背部约3 cm×3 cm区域标记作为M．furfur备毛区、脱去毛发后自然晾干；次日用酒精消毒备毛区后，刮取豚鼠皮屑进行真菌直接镜检、确定为阴性，采用紫外线灯下照射30 min、粗砂纸均匀打磨豚鼠备毛区、涂抹适量无菌橄榄油；模型组于备毛区涂抹0.5 mL新鲜配制的M．furfur菌悬液，对照组于备毛区涂抹0.5 mL生理盐水，每日1次、连续7 d。

1.2.3M．furfur模型的鉴定 建模第8天时，肉眼观察两组豚鼠背部备毛区进行皮损评分、以0～3分计[12]，无皮损为0 分、轻度皮损(>20%备毛区)为1分、中度皮损(备毛区处20%<备毛区<50%备毛区)为2分、重度皮损(>50%备毛区)为3分；然后取豚鼠备毛区皮屑于10%氢氧化钾常规镜检观察是否有M．furfur圆形孢子，同时将皮屑种于含青霉素和链霉素的马拉色固体培养基中，并另接种标准菌株作为对照，培养72 h后，分别提取皮屑阳性菌落与标准菌株菌落的DNA，送武汉天一华煜基因科技有限公司进行Sanger测序，标准菌株菌落序列提交到NCBI中进行Blast比对，再比对皮屑阳性菌落与标准菌落核苷酸序列；最后模型组与对照组各取2只豚鼠麻醉处死，取备毛区皮肤，进行苏木精-伊红染色( hematoxylin-eosin staining，HE )及过碘酸雪夫染色(periodic acid schiff，PAS)染色，观察皮肤组织学改变及马拉色菌孢子数量。

1.2.4小叶苦丁茶水煎液治疗豚鼠M．furfur皮肤感染 小叶苦丁茶水煎液的制备，据文献报道[13]，茶叶外用对人体抗菌作用有效浓度为0.02 g/mL，所以根据人与动物间药物剂量换算方法[14]，得出豚鼠外用浓度约为0.5 g/mL。称取小叶苦丁茶15 g，加入纯水150 mL，加热煎煮20 min后用纱布滤出煎液，滤渣再加纯水100 mL同法煎煮20 min过滤，两次滤液混合加热浓缩成30 mL，即为浓度0.5 g/mL水煎液，备用[15]。

1.2.5M．furfur皮肤感染豚鼠模型分组及处理 将模型鉴定后剩余的12只豚鼠根据M．furfur备毛区皮损评分按照随机数表法分组，随机分为干预组和自然恢复组，每组各6只、雌雄各半。干预组：每只豚鼠按10 mL/kg的剂量，用0.5 g/mL小叶苦丁茶水煎液外涂于豚鼠感染区，连续10 d。自然恢复组涂抹生理盐水。

1.3 观察指标

1.3.1感染区皮损评分 分别于治疗第 0、3、7、10天，观察干预组和自然恢复组豚鼠背部M．furfur感染区的皮损情况并评分。

1.3.2感染区菌落数及转阴率测定 干预组豚鼠末次给予小叶苦丁茶水煎液治疗24 h ，麻醉处死、消毒背部感染区皮肤，每只豚鼠剪下直径为1 cm ×1 cm方形皮损，置于0.9% 生理盐水1 mL的离心管中、充分研磨为匀浆、制成混悬液；取混悬液300 μL接种于含青霉素和链霉素的马拉色固体培养皿、摇匀铺开、培养72 h，记录其菌落数、计算真菌转阴率。培养皿中的菌落数≤1 CFU，即视为阴性[16]；真菌转阴率=每组培养阴性动物数/每组感染动物总数×100%。

1.3.3M．furfur感染豚鼠模型皮肤病理组织及M．furfur孢子检查 造模成功10 d时，取干预组(小叶苦丁茶水煎液治疗10 d)和自然恢复组豚鼠各2只处死，剪取背部感染区处皮肤，4%多聚甲醛溶液固定24 h、石蜡包埋切片，经HE、PAS染色观察皮肤组织学改变及皮肤损伤组织的M．furfur孢子。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 M．furfur感染豚鼠皮肤模型建立

对照组豚鼠皮肤皮损无明显变化，连续感染M．furfur7 d后，肉眼观察M．furfur感染豚鼠皮肤皮损随着时间变化逐渐加重(图1)，背部皮损评分均达到中度以上。模型组皮屑于10%氢氧化钾直接镜检可见圆形孢子，皮屑培养菌落数均>1 CFU，即真菌培养阳性。标准菌株核苷酸序列与NCBI数据库中糠秕马拉色菌序列相似度为100%，且模型组皮屑或毛发培养菌株与标准菌株核苷酸序列相似度为100%，可鉴定为同一菌种，部分测序峰图见图2、图3。皮肤组织HE染色显示，与对照组(图4A)相比，模型组皮肤可见表皮增生，角质层角化过度，角化不全，棘层细胞增厚，皮脂腺增多(图4B、图4C)，镜下可见较多中性粒细胞浸润(图4D)。PAS染色显示角质层及毛囊处出现大量圆形糠秕马拉色菌孢子(图4E、图4F)。

图1 豚鼠皮肤M．furfur备毛区连续7 d的皮损变化Fig.1 Changes of skin lesion in M. furfur-infected area of guinea pigs for 7 days

图2 M．furfur标准菌株DNA ITS1区sanger测序峰图Fig.2 Sanger sequencing map of DNA ITS1 region of M．furfur standard strain

图3 豚鼠M．furfur皮肤备毛区皮屑培养的菌落 DNA ITS1区sanger测序峰图Fig.3 Sanger sequencing map of DNA ITS1 region of bacterial colonies in M. furfur-infected skin of guinea pigs

注：红色箭头代表M．furfur孢子；A为豚鼠对照组皮肤(HE，×100)，B、C为豚鼠模型组皮肤备毛区出现表皮增生、角质层角化过度、角化不全、棘层细胞增厚、皮脂腺增多(HE，×100)，D为豚鼠模型组皮肤备毛区出现较多中性粒细胞浸润(HE，×400)，E、F为豚鼠模型组皮肤备毛区可见大量圆形糠秕马拉色菌孢子(PAS，×1 000)。图4 豚鼠正常组与模型组皮肤显微镜下观察Fig.4 Observation of the skin of guinea pigs in normal group and model group under the microscope

2.2 小叶苦丁茶水煎液对M．furfur皮肤感染模型豚鼠皮损评分的影响

随着苦丁茶水煎液治疗时间的延长，干预组和自然恢复组皮损程度明显减轻(图5)，治疗10 d后，两组皮损评分差异有统计学意义(t=3.968，P=0.003，表1)。干预组豚鼠皮肤感染区已接近豚鼠正常皮肤，自然恢复组还有少量鳞屑和红斑。

图5 小叶苦丁茶水煎液对M．furfur皮肤感染模型豚鼠皮损的影响Fig.5 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on skin lesions of M. furfur-infected guinea pigs

表1 小叶苦丁茶水煎液对M．furfur皮肤感染模型豚鼠皮损评分影响Tab.1 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on skin lesions score of M. furfur-infected guinea

2.3 M．furfur皮肤感染模型豚鼠感染区菌落形成及转阴率影响

小叶苦丁茶水煎液治疗豚鼠M．furfur皮肤感染10 d后，根据Spearman秩和检验，干预组与自然恢复组的菌落数具有差异(H=2.115，P=0.034，表2)。根据Fisher确切概率法，干预组的真菌培养转阴率为66.7%，而自然恢复组的真菌培养转阴率0%。干预组与自然恢复组的真菌培养转阴率差异具有统计学意义(P=0.014，表3)。

表2 两组M．furfur皮肤感染模型豚鼠背部感染区菌落数比较[M(P25，P75)]Tab.2 Comparison of the numbers of bacteria in back infected area of M. furfur-infected guinea pigs between two groups[M(P25，P75)]

表3 两组M．furfur皮肤感染模型豚鼠背部感染区真菌培养转阴率比较Tab.3 Comparison of the fungi negative conversion ratioin back infected area of M. furfur-infected guinea pigs between two groups

2.4 M．furfur皮肤感染模型豚鼠背部感染区组织学变化及M．furfur孢子数量

治疗10 d时HE染色结果显示，与自然恢复组相比，干预组治疗10 d时角质层变薄、皮脂腺减少(图6)。PAS染色结果显示，与自然恢复组相比，干预组未发现圆形M．furfur孢子，而自然恢复组在镜下仍可找到少量的圆形M．furfur孢子(图7)。

3 讨论

马拉色菌是皮肤真菌感染性疾病中最常见的致病菌，可导致花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎，也与头皮糠疹、脂溢性皮炎、特应性皮炎及银屑病等疾病的发病有关。在这些疾病中，M．furfur是临床马拉色菌相关疾病中分离率较高的菌种。而近几年来，由于皮质类固醇激素、广谱抗生素、放化疗药物等的广泛使用，降低了机体免疫力和破坏了皮肤微环境的平衡，从而导致马拉色菌引起的浅部皮肤感染越来越多[17]。

注：红色箭头代表皮脂腺；A为干预组角质层变薄、皮脂腺减少(HE，×100)，B为自然恢复组呈角质层稍厚、皮脂腺多(HE，×100)。图6 小叶苦丁茶水煎液对M．furfur皮肤感染模型豚鼠皮肤组织学改变Fig.6 Skin histological changes of small-leaf Kuding tea decoction on M. furfur-infected guinea pigs

注：红色箭头代表M．furfur孢子；A为干预组未见M．furfur孢子，B为自然恢复组有少量M．furfur孢子。图7 小叶苦丁茶水煎液对皮肤感染豚鼠中M．furfur孢子的影响(PAS，×1 000)Fig.7 Effect of small-leaf Kuding tea decoction on M. furfur spores in infected skin of guinea pigs( PAS,×1 000)

小叶苦丁茶主要生长在我国贵州、云南、四川等地[19]。贵州余庆小叶苦丁茶生长在贵州境内乌江河流域喀斯特地貌、海拔400～800米地区，品质优良、产量高。小叶苦丁茶味微苦，性微寒。传统中医认为，小叶苦丁茶具有清热解毒、消肿止痛等功效[20]。现代药理学研究发现，总黄酮是苦丁茶的主要活性成分之一，在苦丁茶内占据相当大的比重[21]。延永等[22]对苦丁茶总黄酮提取物进行了体外抑菌测试，结果表明苦丁茶中的总黄酮提取物具有抑菌作用，并发现随着黄酮浓度的增加抑菌作用越强。有研究显示总黄酮的抑菌作用与其破坏了细胞的内部结构有关[23]。小叶苦丁茶还具有高硒、低咖啡碱等特点，具有一定的保健价值，且已被证实对人体没有急慢性、致突变以及致畸等毒性，已被正式批准为食品[24]。故本研究基于小叶苦丁茶抗菌抑菌的功效，利用小叶苦丁茶水煎液对M．furfur皮肤感染豚鼠进行治疗观察。

本研究利用7 d连续涂菌法对豚鼠皮肤进行M．furfur感染模型的建立。M．furfur为嗜脂性的条件致病菌，故本实验给予豚鼠高脂饲料喂养，增加食物中脂肪含量以刺激豚鼠皮脂分泌。在涂抹菌液之前，先用磨砂纸打磨豚鼠背部皮肤并涂抹橄榄油，进一步为建模成功创造条件。目前，M．furfur豚鼠皮肤感染无统一的模型鉴定及疗效评价标准。本研究不仅通过肉眼观察测定皮损评分、镜下观察皮屑、皮屑培养菌落计数以及病理组织学检查4个方面进行模型鉴定，还将皮屑培养出的菌落DNA与标准菌株DNA进行序列比对，进一步为模型鉴定提供了可靠依据。本研究中模型鉴定结果表明建模成功。

采用小叶苦丁茶水煎液对豚鼠皮损处进行外涂处理，结果显示，连续用药10 d后，干预组肉眼皮损评分和菌落数均低于自然恢复组，差异具有统计学意义。药物治疗真菌病的疗效评估包括临床治愈和真菌学治愈，而真菌学治愈更为客观。给药10 d后，干预组真菌转阴率均高于自然恢复组，差异具有统计学意义。通过对豚鼠皮损病理组织镜下观察，结果显示小叶苦丁茶水煎液可减轻豚鼠皮肤病变程度，减少感染皮肤组织中孢子数，即小叶苦丁茶水煎液能促进豚鼠糠秕马拉色菌皮肤感染恢复，但其具体机制尚需进一步研究 。

综上，本研究发现小叶苦丁茶水煎液外涂对豚鼠M．furfur皮肤感染恢复有较好的促进作用，这不仅为临床上治疗M．furfur皮肤感染寻找简单有效的方法提供了新的思路，也为进一步开发小叶苦丁茶“食药两用”的应用前景提供了理论依据。