高晓丽，鲍玉琪

（吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033001）

小米，也称之为粟或稷，是禾本科草本植物粟米经加工脱壳后的成品。小米中除富含维生素B1、B12、不饱和脂肪酸外，还含有纤维素、植物甾醇、多酚活性物质、γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）等多种功能性成分[1]。多酚是具有多个酚基团的一类化学元素的总称[2]，小米中所含有的酚类物质包括单宁、植酸、酚酸及其衍生物等，所有这些酚类物质都具有降血糖、抗致突变、抗炎、抗衰老、防辐射等独特的生理功效[3]。GABA是一种游离氨基酸，主要存在于胚芽中，在植物生长发育中发挥保护功能[4]，还可促进酚类物质合成从而增强植物抗逆性[5-7]。其化学性质稳定，具有抗压健脑、增强长期记忆[8]、降血压、抗焦虑[9]、解毒等多种功效[10]。植物中一般GABA含量较低[11]，但在受到刺激时含量会大量提升，如杨树叶在受盐胁迫后GABA含量增加了2倍[12]，机械损伤可使鲜切梨GABA累积[13]，而粟米发芽过程中因相关内源酶激活而使发芽小米中酚类、黄酮类化合物及GABA的含量提升[14-15]。

基于发芽谷物较高的营养价值，目前国内有较多的相关研究。徐丽[16]的研究发现经发芽处理的小米GABA含量提高了2.9倍，其得率为251.46 mg/100 g；李彩云[17]的研究表明粟谷样品中黄酮、总氨基酸含量和必需氨基酸含量会随发芽时间的延长而增加；沙坤等[18]的研究发现粟米在发芽过程中总酚含量逐渐增加，在72 h后趋于平缓，总酚含量达到约1.7 mg/g。以上研究都表明发芽可以有效提升小米中GABA和多酚的含量。

超声波辅助表面活性剂提取法与传统提取法相比，因具有提取时间短、效率高的优点而被广泛研究与应用。陈琼等[19]的研究表明此法能优化青钱柳中总黄酮的提取；肖道安[20]在吐温80协同酶法提取桑叶总黄酮的研究中发现吐温80有显著的增溶作用。本文旨在通过超声辅助-表面活性剂法富集发芽小米中GABA和多酚物质的含量，提高发芽小米GABA和多酚的得率，为其工业化生产提供理论依据，以期降低成产成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷米：山西天公种业有限公司；谷芽：安国市广盛商贸有限公司；吐温80（化学纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；γ-氨基丁酸标准品（色谱纯98%）：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸标准品（色谱纯98%）、福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；次氯酸钠、重蒸酚、硼酸（化学纯）：天津市化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗机（SB-3200DTDN）：宁波新芝生物科技股份有限公司；生化培养箱（SPX-250）：上海跃进医疗器械有限公司；高速万能粉碎机（FW-400A）：北京科伟永兴仪器有限公司；可见分光光度计（VIS-723N）：北京瑞利分析仪器有限公司；台式高速离心机（Neofuge13）：上海力申科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发芽小米制备与前处理

谷米经除杂和清洗后与3.5 mmoL/L的CaCl2溶液以 1∶10（mg/mL）的比例混合，35℃下浸泡 12 h后平铺放入垫有滤纸的培养皿内，再覆盖上六层纱布，控制发芽湿度95%，在30℃下发芽72 h，之后45℃下烘干制得成品发芽小米。

参考宁亚维等[21]的方法脱除发芽小米中的黄色素：准确称取干燥后的发芽小米粉1.0 g置于锥形瓶中，首先加入5 mL无水乙醇提取发芽小米中的黄色素，于60℃水浴保温2 h，然后于8 000 r/min、离心20 min以后，上清液即为黄色素提取液，将其弃去留取沉淀物。1.3.2 GABA的提取和优化试验

1.3.2.1 GABA的提取与测定

取上述沉淀物，按一定料液比加入吐温80溶液，设置提取温度、超声功率，经超声提取后，测定GABA得率。空白对照：脱去黄色素的沉淀物加10倍蒸馏水于40℃下浸提1 h，每隔10 min摇动一次，得粗提液。粗提液于10 000 r/min条件下离心15 min后得到待测提取液，测定GABA得率。参照赵大伟等[22]的方法绘制标准曲线并测定GABA含量。

1.3.2.2 单因素试验

取脱除黄色素的发芽小米沉淀物5份，设置不同吐温80质量分数（0%、2%、4%、6%、8%）、超声温度（20、25、30、35、40 ℃）、超声时间（5、15、25、35、45 min）、料液比[1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22（g/mL）]、超声功率（90、108、126、144、162 W），研究各单因素对 GABA 得率的影响。以吐温80质量分数4%、料液比1∶20（g/mL）、超声温度25℃、超声时间15 min、超声功率126 W为基准进行试验。

1.3.2.3 正交试验

以GABA得率为指标，以吐温80质量分数、超声温度、超声时间、料液比和超声功率5个因素作为影响发芽小米多酚得率的主要因素，并设计L16（45）正交试验，正交试验因素水平见表1。

表1 GABA提取正交试验因素水平Table 1 Factor level of GABA extraction orthogonal test

1.3.3 多酚的提取和优化试验

1.3.3.1 多酚提取与测定

取脱去黄色素的发芽小米沉淀物，加入5倍质量、体积分数为60%的乙醇和一定量的吐温80溶液，设定超声功率162 W，在不同温度下提取多酚，测其得率。

空白对照：取脱去黄色素后的沉淀物，加入5倍70%的乙醇，真空抽滤后在5 000 r/min的条件下离心10 min，定容得到待测提取液。多酚含量测定参照朱仙慕等[23]和王若兰等[24]的Folin-Ciocaltue法测定。

1.3.3.2 单因素试验

取经脱去黄色素的发芽小米沉淀物5份，设置不同吐温80质量分数（5%、10%、15%、20%、25%）、超声温度（25、35、45、55、65 ℃）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]作为4个单因素，考察各因素对多酚得率的影响。以吐温80质量分数 10%、料液比 1∶10（g/mL），超声温度 45℃、超声时间10 min为基准试验条件。

1.3.3.3 响应面试验

以吐温80质量分数、超声温度、超声时间、料液比4个因素为自变量，选取得率较高的3个水平，以多酚得率为响应值，分析各因素对响应值的影响。响应面试验设计见表2。

表2 响应面试验设计Table 2 Response surface experimental design

1.4 数据处理

用origin 2018进行数据处理及图表绘制；采用正交设计软件进行正交设计及方差分析确定发芽小米GABA最佳提取工艺；采用Design-Expert 10.0软件设计响应面试验，并进行方差分析优化多酚提取工艺。

2 结果与分析

2.1 GABA的提取

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 吐温80质量分数对GABA得率的影响

吐温80质量分数对GABA得率的影响见图1。

图1 吐温80质量分数对GABA得率的影响Fig.1 Effect of Tween 80 mass fraction on GABA yield

经试验得到空白对照组GABA的得率为1.213mg/g。由图1可知，与空白组相比，加入吐温80后GABA的得率大幅度增加，原因可能是由于GABA自身极易溶于水，且吐温80作为增溶剂可以降低溶液表面张力，更利于被超声波破碎的细胞中易溶性物质的浸出；吐温80质量分数大于2%时，随着吐温80质量分数的增加，GABA的得率不断减小，其原因可能是吐温80质量分数达到了临界胶束浓度，且其对其它杂质的增溶作用也会影响吸光度的大小[25]。由此可以确定最佳吐温80质量分数为2%。

2.1.1.2 超声温度对GABA得率的影响

超声温度对GABA得率的影响见图2。

图2 超声温度对GABA得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on GABA yield

由图2可知，GABA得率随超声温度的升高先增大后减少，当超声温度为30℃时得率最高。此变化的原因可能是温度较低，分子的热运动缓慢，在较短的时间不能完全浸出；当温度上升至超过30℃时，其得率下降，原因可能是由于，温度过高，破坏了GABA结构，使得GABA从提取液中析出，其得率反而下降[26]，可初步确定因素最佳水平为30℃。

2.1.1.3 超声时间对GABA得率的影响

超声时间对GABA得率的影响见图3。

图3 超声时间对GABA得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on GABA yield

由图3可知，在控制其它条件不变的情况下，随超声时间的延长，GABA得率在5 min～25 min内不断增加，当超声时间达到25 min时，发芽小米GABA的得率达到最大值（2.219 mg/g）；而继续延长超声波提取时间，GABA得率的增加效果并不明显，且逐渐趋于平稳。可能是因为在此条件下，提取液中溶质浓度已经达到固液平衡，延长超声时间提取效果优化并不明显。确定GABA适宜的超声提取时间为25 min。

2.1.1.4 料液比对GABA得率的影响

料液比对GABA得率的影响见图4。

图4 料液比对GABA得率的影响Fig.4 Effect of material liquid ratio on GABA yield

由图 4 可知，料液比为 1∶14（g/mL）～1∶20（g/mL）时，随着提取溶剂用量的增加，发芽小米粉与料液的接触面积增大，使得GABA的得率增加；在1∶20（g/mL）之后，继续增加浓度差不仅使得单位提取液中GABA的浓度降低，而且增大提取溶剂用量的同时会增加生产成本，因此从生产成本和GABA提取效果两个角度考虑，确定最佳的提取料液比为1∶20（g/mL）。

2.1.1.5 超声功率对GABA得率的影响

超声功率对GABA得率的影响见图5。

图5 超声功率对GABA得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on GABA yield

由图5可知，GABA得率随着超声功率的增加先增大，当超声功率为126 W时得率达到最大值，这可能是由于在90 W～108 W内，随超声功率增加其振动频率也增大，分子热运动加剧，使得GABA更容易溶出[27]，故其得率不断增加；超声功率在108 W～126 W时，GABA的增长幅度较小，可能是因为超声波对发芽小米细胞的破坏作用使得GABA的溶出较完全，继续增大功率其得率不会显著增大；当超声功率大于126 W时，GABA得率降低，但降低趋势较为平缓。其原因可能是尽管GABA分子结构稳定，但超声波功率过高也会对GABA分子结构有一定的破坏作用，影响其得率。因此从节约能源和提取效果两方面考虑，确定最适超声功率为126 W。

2.1.2 正交优化试验

正交试验设计及结果如表3所示。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，正交试验最佳提取工艺条件为A3B4C2D2E2，即吐温80质量分数6%，超声温度为35℃，超声时间 25 min，料液比 1∶18（g/mL），超声功率为126 W。比较4个因素的极差大小可知对评价指标影响的大小关系依次为A、E、D、B、C，其中吐温80质量分数对得率的影响最大，其次是超声功率、料液比、超声温度，超声时间的影响最小。

对数据进行方差分析，结果见表4和表5。

表4 方差分析（a=0.05）Table 4 Analysis of variance

表5 方差分析（a=0.01）Table 5 Analysis of variance

方差分析结果表明在a=0.05时，5个因素对GABA得率无显著性影响；在a=0.01时，A对GABA得率有显著性影响。综上所述，最佳提取工艺条件为A3B4C2D2E2，即吐温80质量分数6%，超声温度为35℃，超声时间25 min，料液比 1∶18（g/mL），超声功率为 126 W。

2.1.3 验证试验

根据正交试验结果，最佳条件下得到发芽小米GABA的最终得率为4.70 mg/g，优于其它试验组。

2.2 多酚提取

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 吐温80质量分数对多酚得率的影响

吐温80质量分数对多酚得率的影响见图6。

经试验得到空白对照组多酚得率为0.651 mg/g。由图6可知，在吐温80质量分数为5%～10%时，多酚得率随其浓度的增加而增大，这可能是由于吐温80的增溶作用加速了多酚物质的浸出；但当吐温80质量分数大于10%时，得率开始不断降低，原因可能是其浓度过高大于临界胶束浓度，溶入胶束中的多酚活性物质的再溶出受到阻碍[28]，引起多酚得率下降。

图6 吐温80质量分数对多酚得率的影响Fig.6 Effect of Tween 80 mass fraction on polyphenol yield

2.2.1.2 超声温度对多酚得率的影响

超声温度对多酚得率的影响见图7。

图7 超声温度对多酚得率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield

由图7可知，多酚得率在25℃～45℃时，随温度的升高而升高，当温度达到45℃时，多酚得率达到峰值，呈现此变化趋势的原因可能是淀粉加速破裂加快了多酚物质溶出以及吐温80分子的热运动加剧有利于对多酚的浸提；继续升高温度多酚的得率反而下降，其原因可能是由于高温破坏了多酚的结构且会使溶剂蒸发，导致料液比发生变化，多酚得率减少。因此选择超声温度45℃较为适宜。

2.2.1.3 超声时间对多酚得率的影响

超声时间对多酚得率的影响见图8。

图8 超声时间对多酚得率的影响Fig.8 Effect of ultrasonic time on polyphenol yield

由图8可知，在超声时间为0～20 min时，多酚得率大幅度增加，呈现此趋势可能是由于延长超声时间，超声波的机械作用加速多酚物质的溶出，使多酚得率增加；超声时间在20 min时，多酚得率达到最高点；之后再延长超声时间，多酚得率急剧下降，可能是因为多酚分子结构不稳定，在超声波的空化作用产生的羟基自由基的作用下使得多酚氧化速率加快[29]，造成多酚物质的得率降低，与此同时长时间暴露于空气中的多酚易于被氧化和分解。故选取20 min为最佳超声提取时间。

2.2.1.4 料液比对多酚得率的影响

料液比对多酚得率的影响见图9。

图9 料液比多酚对得率的影响Fig.9 Effect of material liquid ratio on polyphenol yield

由图 9 可知，料液比在 1∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）时，发芽小米粉中多酚的得率因提取溶剂用量的增多而增加，料液比为 1∶15（g/mL）时，多酚得率最高；当溶剂用量继续增加时，多酚得率反而降低，这可能是在此条件下提取溶剂的浓度梯度达到极限值。提取原料和提取溶剂的浓度梯度是提取物溶出的动力，较大的浓度梯度有利于提取物的溶出，但当此浓度梯度达到一定极限时，继续增加浓度梯度对提取物的溶出反而起抑制作用[30]，因此料液比选择 1∶15（g/mL）最合适。

2.2.2 多酚提取优化试验

响应面设计及结果如表6所示。

表6 响应面试验结果Table 6 Response surface test results

用Design Expert10.0软件对此模型进行分析，经拟合后得到该模型的回归多项式方程：Y=1.97-0.089A-0.13B-0.056C+0.066D+0.057AB-0.11AC-0.18AD+0.26BC-0.082BD+0.027CD-0.34A2-0.36B2-0.38C2-0.27D2。

方差分析结果见表7。

由表7可知，此提取模型的P值小于0.000 1，说明该模型为极显著，适用于发芽小米多酚提取过程；失拟误差项P值为0.190 4>0.05，说明其为不显著，即模型与试验值的误差较小；其决定系数R2=0.964 5，说明发芽小米多酚提取得率的试验值与预测值之间有较高的拟合度；Radj2=0.929 1，Rpred2=0.815 9，两者的差异较小，表明此模型可较好的描述各因素与响应值之间的关系；信噪比为17.436大于4，即表示该模型可以用于预测。此二次回归模型中因素C、D、AC对多酚得率的影响显著；A、AD对多酚得率的影响为高度显著；B、BC、A2、B2、C2、D2对多酚得率的影响为极显著；因素AB、BD、CD对多酚得率的影响为不显著。各因素的均方值可以反映出试验因素对响应值多酚得率的重要性，均方值越大，表明对响应值的影响程度越大。从表7可得对响应值影响大小的因素依次为B>A>D>C。

表7 回归方程的方差分析及显著性检验Table 7 Variance analysis and significance test of regression equation

用响应面软件得到各因素之间交互作用强弱的曲面图和等高线图，见图10。

图10 各因素两两之间交互作用的曲面图和等高线图Fig.10 Surface diagram and contour map of the interaction between two single factors

由图10依据等高线图的形状可以较为清晰观察出响应值交互作用的显著性，AC、AD、BC为椭圆形表示交互作用显著，AB、BD、CD近似为圆形表示交互作用不显著。

2.2.3 验证试验

依据响应面预测结果，最佳工艺条件：吐温80质量分数9%、超声温度42℃、超声时间19 min、料液比1∶12.5（g/mL），在此条件下得到发芽小米多酚得率为1.99 mg/g，与预测值接近。

3 结论

本文以发芽小米为研究对象，采用超声辅助表面活性剂法提取发芽小米中的GABA和多酚物质。以吐温80水溶液作为提取剂，在料液比1∶18（g/mL），吐温80质量分数6%，超声功率为126 W，超声时间25 min，超声温度35℃的条件下，发芽小米GABA得率最高，为4.70 mg/g。以吐温80水溶液和60%的乙醇溶液作为浸提溶剂，通过响应面分析法优化发芽小米多酚提取工艺，结果表明最佳提取工艺条件为吐温80质量分数为9%、超声温度为42℃、超声时间为19 min、料液比为1∶12.5（g/mL）时，多酚得率为 1.99 mg/g。本研究对发芽作物活性物质的提取工艺进行优化，在本研究中首次将吐温80应用于发芽小米GABA和多酚的提取，并采用超声予以辅助，有效提升了GABA和多酚的得率，可为发芽产品以及活性物质的开发利用提供理论依据。