马露燕，郭兴凤，朱婷伟，田亚东，段晓杰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

植物蛋白质作为一种来源广泛的天然食品级大分子，因其具有独特的界面特性、良好的乳化特性使其在乳液体系构建研究过程中得到了人们的广泛关注[1]。尤其是豌豆蛋白营养价值高，且不含过敏原，成为近年来一种新兴的优质植物蛋白来源[2-3]。但豌豆蛋白在大规模商业生产时功能性质（乳化性、溶解性等）会变差，因而仅作为副产物，造成豌豆蛋白资源的浪费[4]。要解决豌豆蛋白的局限性，进一步提高其营养和加工应用价值，需进一步对豌豆蛋白进行改性。研究表明，蛋白质和糖经过糖基化反应，可提高蛋白质溶解度，且蛋白质-多糖结合物能表现出更好的乳化活性和乳化稳定性[5-7]，其优良的乳化性能归因于两者优异的两亲性[8]。且该方法不需要提供特殊装置，相对简单、安全、绿色，在功能性蛋白制品生产中有很大的发展空间[9-10]。本课题组前期研究发现，大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）和乳糖在相对湿度79%，温度60℃条件下发生干法糖基化反应，制备不同接枝度的SPI-乳糖共价复合物，反应24 h后复合物的溶解性和乳化特性明显提高[11]。因此，有望通过糖基化改性来改善豌豆蛋白的乳化特性。

在糖基化反应过程中，糖基供体的选择及反应条件都会影响糖基化产物的功能特性。在糖基供体选择中，低聚木糖一方面可通过糖基化改性修饰蛋白结构来改善蛋白质的功能特性；另一方面也可作为益生元被人体肠道中的细菌发酵利用，选择性地促进肠道益生菌的生长，进而有益于机体健康[12-13]。此外，糖基化反应中，蛋白质与低聚糖的糖基化速度比多糖快得多，其可作为多糖的良好替代品[14]。基于此，本文利用低聚木糖通过糖基化修饰豌豆蛋白，以乳化特性为评判指标，优化糖基化反应条件。研究蛋白质与糖质量比、反应温度、反应时间等条件对糖基化复合物乳化特性的影响；并通过响应面法对反应条件进一步进行优化，最终获得低聚木糖糖基化下乳化特性较好的豌豆蛋白糖基化复合物的制备条件，以期为豌豆蛋白在乳液体系中的应用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆蛋白（蛋白质含量≥85%）、低聚木糖（≥95%，食品级）：西安金硕果业有限公司；大豆油：益海（周口）粮油工业有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（≥99%，分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；双蒸水：河南工业大学粮油食品学院8349实验室自制。

1.2 仪器与设备

可见光分光光度计（722S型）：上海精密科学仪器有限公司；高速剪切均质机（GL-20C型）：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6型）、磁力搅拌器（JJ-6A型）：常州普天仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆蛋白-低聚木糖糖基化复合物的制备

参考文献[15]采用湿法糖基化方法，将豌豆蛋白与低聚木糖按一定的质量比溶解于蒸馏水中，并保持蛋白浓度为1%，磁力搅拌2 h混匀，调节pH值为7，于4℃冰箱中放置过夜，使其充分水合。将样品放置在75℃水浴锅中反应90 min，取出在冰水中冷却5 min，以终止反应，得到糖基化产物。

1.3.2 乳化特性的测定

参考文献[16]测定糖基化产物的乳化特性：取15mL糖基化样品溶液，加入5 mL大豆油混合后进行剪切[室温（25 ℃）、12 000 r/min、2 min]处理。剪切处理后分别在0、10 min从底部取样50 μL，加入5 mL 0.1%SDS，测定500 nm处的吸光值，以SDS溶液为空白。乳化活性计算公式如下。

式中：A500为500 nm处的吸光值；N是稀释倍数；Φ是体系中油相所占体积分数；C是蛋白质的浓度，g/mL；L是比色皿光径，1 cm。

乳化稳定性计算公式如下。

式中：A0为0min的吸光值；A10为10min的吸光值。

1.3.3 豌豆蛋白与低聚木糖质量比对豌豆蛋白乳化特性的影响

调节溶液pH值分别为7.0，反应温度为70℃，控制糖基化反应时间为90 min，调控豌豆蛋白与低聚木糖质量比分别为 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，测定不同豌豆蛋白与低聚木糖质量比下糖基化产物的乳化特性。

1.3.4 反应温度对豌豆蛋白乳化特性的影响。

调节溶液pH值分别为7.0，控制豌豆蛋白与低聚木糖质量比为2∶1，糖基化反应时间为90 min，调控反应温度分别为70、80、90、100℃，测定不同反应温度下糖基化产物的乳化特性。

1.3.5 反应时间对豌豆蛋白乳化特性的影响

调节溶液pH值分别为7.0，控制豌豆蛋白与低聚木糖质量比为2∶1，反应温度为80℃，调控糖基化反应时间分别为30、60、90、120 min，测定不同反应时间下糖基化产物的乳化特性。

1.3.6 Box-Behnken响应面试验

在单因素试验的基础上，选择反应温度、反应时间、豌豆蛋白与低聚木糖质量比3个因素为自变量，以产物的乳化特性为响应值设计试验，研究各自变量及其交互作用对豌豆蛋白乳化特性的影响，进一步优化低聚木糖糖基化豌豆蛋白改性工艺的最佳参数。

设计类型为三因素三水平共17个试验点，其中5个为中心试验，12个为析因试验，利用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合及方差分析，试验因素水平如表1所示。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 数据处理

采用SPSS 20、Excel软件对试验数据进行处理、作图及显著性分析，显著性水平设为0.05。采用Design Expert 8.0.6软件对响应面数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 反应条件对豌豆蛋白乳化特性的影响

2.1.1 豌豆蛋白与低聚木糖质量比对豌豆蛋白乳化特性的影响

在豌豆蛋白浓度为1%，反应温度为70℃，反应时间为90 min时，豌豆蛋白与低聚木糖质量比对糖基化反应过程中豌豆蛋白乳化特性的影响如图1所示。

图1 豌豆蛋白与低聚木糖质量比对改性豌豆蛋白乳化特性的影响Fig.1 Effect of mass ratio of pea protein to xylooligosaccharide on emulsifying properties of modified pea protein

由图1可知，随着豌豆蛋白与低聚木糖质量比的增加，豌豆蛋白糖基化产物的乳化活性和乳化稳定性均呈现先上升后下降的趋势。在一定的豌豆蛋白与低聚木糖质量比下，溶液黏性可使糖分子与蛋白质分子接触机会增大，糖基化反应顺利进行；低聚木糖附着在蛋白质表面增加了空间位阻，因此油滴不易聚集和凝结，从而表现出糖基化产物乳化活性和乳化稳定性提高[17]。当糖分子过多，溶液黏性随之增加，反而不利于糖基化反应进行，导致乳化特性较差[18]。可见适当的蛋白质与糖的质量比有利于获得乳化特性较好的糖基化产物。因此，确定豌豆蛋白与低聚木糖的质量比为2∶1，此时糖基化产物具有高的乳化特性，乳化活性和乳化稳定性分别为10.34 m2/g和61.75%。

2.1.2 反应温度对豌豆蛋白乳化特性的影响

在豌豆蛋白浓度为1%，豌豆蛋白与低聚木糖质量比为2∶1，反应时间为90 min时，反应温度对糖基化反应过程中豌豆蛋白乳化特性的影响见图2。

图2 反应温度对改性豌豆蛋白乳化特性的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on emulsifying properties of modified pea protein

由图2可知，整体上，随着反应温度的升高，糖基化产物的乳化活性和乳化稳定性呈现先升高后下降的趋势。当反应温度在80℃时，糖基化产物具有较好的乳化特性(乳化活性12.3 m2/g，乳化稳定性70.15%)，不同反应温度的乳化稳定性无显著性差异，故以乳化活性最高为最佳反应温度。反应温度是影响糖基化反应进程的一个重要指标，适当的反应温度，使蛋白质变性伸展，多肽链被解聚成小分子肽和游离氨基酸，加快了糖与蛋白质的结合，使乳化活性升高；反应温度过高时，蛋白质分子发生聚集，不利于糖和蛋白质的结合[19]。

2.1.3 反应时间对豌豆蛋白乳化特性的影响

当豌豆蛋白浓度为1%，豌豆蛋白与低聚木糖质量比为2∶1，反应温度为70℃时，反应时间对糖基化反应过程中豌豆蛋白乳化特性的影响如图3所示。

图3 反应时间对改性豌豆蛋白乳化特性的影响Fig.3 Effect of reaction time on emulsifying properties of modified pea protein

由图3可知，在0～120 min的反应时间段，随着反应时间的延长，乳化活性和乳化稳定性均呈现先增加后降低的趋势。这是由于随着反应时间的延长，糖和蛋白质不断结合，乳化活性随之提高，而反应时间过长，更多的亲水性糖分子附着在豌豆蛋白上，这会相应地降低乳化活性[20]。当反应时间为60 min时，糖基化产物具有较好的乳化活性，乳化稳定性无显著变化，此时乳化活性为11.83 m2/g；乳化稳定性为56.20%。

2.2 最佳反应条件的确定

在反应温度（A）、反应时间（B）、豌豆蛋白与低聚木糖质量比（C）单因素研究的基础上，以乳化特性（乳化活性和乳化稳定性）为响应指标，采用Box-Benhnken响应面优化设计方案，具体设计方案及试验结果见表2。同时对结果进行多元回归分析，结果如表3和表4所示。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 乳化活性回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of emulsifying activity regression model

表4 乳化稳定性回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of emulsifying stability regression model

以反应温度（A）、反应时间（B）、豌豆蛋白与低聚木糖质量比（C）为自变量，通过对优化结果进行多元回归分析得到乳化活性（Y1）、乳化稳定性（Y2）和反应条件之间的二次多项式回归方程分别为Y1=-23.567 04+0.692 45A+0.107 12B+4.843 50C-0.000 305AB-0.006AC-0.017 7BC-0.004 315A2-0.000 306 4B2-0.651C2，R2=0.962 1；Y2=-65.164 68+2.2648 0A+0.721 66B+0.721 66C-0.004 562 5AB+0.145 87AC-0.111 15BC-0.014 364A2-0.000 786 3B2-2.935 75C2，R2=0.967 7。其中，由模型拟合F检验值可知，乳化活性F=19.72，P 值=0.000 4<0.01，乳化稳定性 F=23.29，P值=0.000 2<0.01，说明该模型拟合性较好，达到显著水平；同时，失拟项：乳化活性F=3.31，P值=0.139 1>0.05，乳化稳定性 F=1.67，P 值=0.309 5>0.05，模型失拟性检验不显著。去掉对乳化活性影响不显著的交互因素 AB、AC 后模型 R2=0.948 5、调整 R2=0.908 5、预测R2=0.772 8、变异系数=4.02。对于乳化稳定性模型R2=0.967 7、调整 R2=0.926 1、预测 R2=0.690 1、变异系数=2.93。结果表明该模型拟合度好，可以很好地对响应值（乳化特性）进行预测。

由表3和表4得到的回归方程系数显著性检验可得，选取的反应温度、反应时间及豌豆蛋白与低聚木糖质量比3个因素对豌豆蛋白糖基化复合物的乳化特性有重要影响。对一次项回归系数的绝对值大小排序，可得乳化活性中3个因素的影响顺序为C>A>B，乳化稳定性3个因素的影响顺序为C>B>A。此外，交互作用中，一次项A、B、C，交互项BC，二次交互项A2、B2对改性豌豆蛋白乳化活性影响极显著，二次项C2影响显著。一次项B、C，交互项AB、AC、BC，二次交互项A2、C2对改性豌豆蛋白乳化稳定性影响极显著，二次项B2影响显著。这说明各因素对糖基化产物的乳化活性和乳化稳定性的影响不是简单的线性关系。

为进一步研究各因素之间交互作用对豌豆蛋白乳化特性的影响，用Design-Expert 8.0.6进行各因素之间的交互作用响应面分析，结果如图4和图5所示。

图4 各因素交互作用对乳化活性影响的响应面图Fig.4 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying activity

图5 各因素交互作用对乳化稳定性影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of influence of interaction of various factors on emulsifying stability

图4直观反映出蛋白-糖质量比和反应时间对豌豆蛋白乳化活性的影响，当豌豆蛋白与低聚木糖质量比固定时，乳化活性随着反应时间的增加呈先升高后降低的趋势；图5直观反映出各影响因素交互作用对乳化稳定性的影响，当豌豆蛋白与低聚木糖质量比不变时，乳化稳定性随着反应温度的增加呈先升高后降低的趋势。

2.3 最佳工艺条件验证

试验表明，豌豆蛋白与低聚木糖质量比、反应温度、反应时间均可影响糖基化反应进程，进而影响糖基化产物乳化特性的变化。采用Design-Expert 8.0.6进行模型预测，预测工艺条件为反应温度74.63℃、反应时间93.65 min、豌豆蛋白与低聚木糖质量比1.86∶1，预测改性豌豆蛋白的乳化活性为12.13 m2/g、乳化稳定性为60.44%。根据实际试验条件，在反应温度75℃、反应时间90 min、豌豆蛋白与低聚木糖质量比2∶1条件下测得乳化活性为12.32 m2/g、乳化稳定性为59.64%，调整后预测改性豌豆蛋白的乳化活性为12.19 m2/g、乳化稳定性为60.16%。实际值与预测理论值接近，说明此模型优化结果可靠。

3 结论

本试验以豌豆蛋白与低聚木糖为原料，采用湿法糖基化方法制备豌豆蛋白-低聚木糖复合物。通过单因素试验和响应面法建立糖基化复合物制备条件（豌豆蛋白与低聚木糖质量比、反应温度、反应时间）的数学模型，根据回归方程分析及预测模型，得到最佳制备工艺条件。整体上，模型拟合度好，可以很好地对反应过程中豌豆蛋白乳化特性进行预测。这3个因素对豌豆蛋白乳化活性影响大小为豌豆蛋白与低聚木糖质量比>反应温度>反应时间；对乳化稳定性影响大小为蛋白-糖比例>反应时间>反应温度。最佳工艺条件为反应温度75℃、反应时间90 min、豌豆蛋白与低聚木糖质量比2∶1，测得乳化活性为12.32 m2/g、乳化稳定性为59.64%。该研究将为豌豆蛋白在乳液体系中的应用奠定基础。