李生华，张观兰，李建棣，杨艺洲,3，许静婕,3，庞秋愉,4，陈思智,3，杨小萱,3，唐 邓，李东明，唐玉露，党裔武，陈 罡，黄志广△

(1.广西医科大学第一附属医院泌尿外科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院病理科，广西 南宁 530021；3.广西医科大学临床医学系，广西 南宁 530021；4.广西医科大学法医系，广西 南宁 530021)

肾细胞癌是发生在肾小管上皮的恶性肿瘤，主要分为肾透明细胞癌和肾非透明细胞癌。肾非透明细胞癌中肾嫌色细胞癌(chRCC)在1985年由THOENES和COLLS等首先报道，约占肾脏肿瘤的5%[1]。chRCC好发于50～60岁中年人群，多为体检偶然发现，病理活检仍为目前临床确诊的“金标准”。随着生活水平和医疗技术的提高，相较其他常见亚型的肾脏肿瘤，chRCC发病率并不高，但患者数量不少。有研究显示，chRCC具有恶性潜能，约6.2%的肿瘤可发生复发或转移[2]。因此，近年来chRCC逐渐受到关注和重视。CLDN8(Claudin8)基因位于人类染色体21q22.11上，是一种参与构成紧密连接的跨膜蛋白，通过形成膜内原纤维构成紧密连接的骨架，其羧基末端的PDZ结构能与其他紧密连接蛋白分子相互作用，从而固定在紧密连接复合体上[3]，在维持紧密连接的结构和功能中发挥重要作用。细胞-细胞和细胞-基质黏附分子不仅对组织的完整性至关重要，而且参与多种细胞行为的信号传导，细胞黏附分子和转录因子的不同组合可协调各种生理和病理过程，包括癌症[4]。如，卵巢癌患者腹水中的肿瘤细胞被发现与细胞黏附和细胞屏障完整性相关的基因上调[5]，CLDNs家族基因高表达于胃癌，有望作为胃癌治疗的新靶标[6]。目前研究发现，肾透明细胞癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、骨肉瘤中都检测到CLDN8的异常表达，且与细胞癌变及紧密连接功能缺失密切相关[7]。如，CLDN8在肾透明细胞癌中显著低表达，CLDN8被认为可抑制肾透明细胞癌细胞系通过上皮细胞间质转化(EMT)和蛋白激酶B途径进行增生、转化和侵袭的过程[8]。另外，CLDN8通过雄激素受体信号通路促进前列腺癌细胞的增生和转移[9]；通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路促进结直肠癌细胞增生、转移和侵袭[10]。CLDN8被检测到在乳腺癌中低表达且与雄激素受体呈正相关，具体机制未知[11]。体外实验表明，CLDN8敲低可通过阻滞U2OS骨肉瘤细胞G1-S转化，从而抑制骨肉瘤细胞系生长[12]。目前，关于CLDN8参与chRCC的发生发展的文献较少见。本文拟通过收集全球范围内公共数据库中chRCC组织相关数据集，分析CLDN8 mRNA在chRCC组织中的表达情况，并结合免疫组织化学染色(IHC)对临床病理样本进行验证，进而探索CLDN8在chRCC中的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 通过Gene Expression Omnibus(GEO)、Sequence Read Archive(SRA)、ArrayExpress数据库获取chRCC mRNA表达数据集，检索式为“Kidney chromophobe”OR“KICH”OR“chromophil renal cell carcinoma”OR“chromophobe renal cell carcinoma”OR“chRCC”。检索时间为建库至2021年6月1日。纳入标准：(1)数据集来源是人类；(2)包含组织mRNA测序数据；(3)同时具有chRCC组和非chRCC组，非chRCC组为癌旁组织或正常肾组织，2组数目均大于或等于3。排除标准：(1)数据集来源是细胞；(2)经过基因敲除或药物处理。此外，通过R包TCGAbiolinks获取癌症基因组图谱(TCGA)数据库中chRCC经RNA测序的计数数据集(建库至2021年7月12日)，正常肾组织RNA测序基因读取计数矩阵下载自Genotype-Tissue Expression(GTEx)数据库。研究使用的组织芯片购买自桂林泛谱生物技术有限公司，包括11份chRCC组织标本和16份非chRCC组织标本(In-house TMA数据集)。本研究所用标本、方法均获得桂林泛谱生物技术有限公司和广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2方法 (1)技术路线：分析chRCC组织、非chRCC组织CLDN8 mRNA及蛋白表达差异，并通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线、汇总ROC(sROC)曲线及计算灵敏度、特异度、阳性似然比等指标，分析CLDN8对chRCC的诊断效能。(2)mRNA数据集处理：TCGA数据集与GTEx数据库下载的正常肾组织RNA测序基因读取计数矩阵经过合并、批次处理、TPM(transcript per kilobase of exon model per million mapped reads)标准化形成一个独立的TCGA-GTEx数据集。最终，对没有标准化的数据集进行log2(x+1)归一化处理用于后续分析。(3)CLDN8蛋白表达检测：通过IHC来检测CLDN8蛋白在chRCC中的表达情况，各步骤严格按照试剂盒说明书进行。IHC结果将由2位病理专家分别按照免疫组化染色评分(IRS)系统(0～12分)进行阅片评分[13]。染色强度分为0、1、2、3，分别表示阴性、弱、中、强。阳性染色比例分类如下：0为无细胞染色，1为小于10%，2为11%～50%，3为51%～80%，4为81%～100%。阳性染色比例与染色强度分数的乘积即为对应视野的最终得分。每个样本取5个不同视野依照IRS评分系统进行评分，最后取5个视野评分的算术平均数作为该样本的最终得分。所有样本的评分汇总作为一个数据集用于后续分析。兔抗人CLDN8多克隆抗体购自英国Abcam公司，第二抗体品名为中杉金桥(货号：PV-6000)，DAB显色试剂盒(20×)购自福州迈新生物公司(货号：DAB-0031)。

1.3统计学处理 通过GraphPad Prism8.0.2软件进行非配对两独立样本t检验分析CLDN8在chRCC组织与非chRCC组织中表达差异，绘制散点图对结果进行可视化分析。分析ROC曲线获得真阳性数、真阴性数、假阳性数、假阴性数。通过Stata12.0软件合并标准化均数差(SMD)效应量，计算灵敏度、特异度、似然比，绘制sROC曲线及发表偏倚检验漏斗图。采用sROC曲线下面积(AUC)用于评估CLDN8潜在诊断效能,其中>0.5～0.7为诊断效能较低，>0.7～0.8为诊断效能一般，>0.8～0.9为诊断效能较高，>0.9为诊断效能很高。采用Deeks′漏斗图和Egger′s检验评估发表偏倚检验。Q检验和I2可分别定性、定量进行异质性检验，若Q检验有统计学意义(P<0.10)，表明研究存在异质性,其中I2≤40%时异质性可忽略不计；I2为30%～60%时存在一定程度异质性；I2≥50%异质性较明显。当Q检验P<0.10且I2>50%时，合并效应量SMD选用随机效应模型，否则采用固定效应模型。

2 结 果

2.1数据收集情况 从公共数据库获得4个数据集，分别是GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx，其中GSE11151数据集中chRCC组织标本4份，非chRCC组织标本5份；GSE15641数据集中chRCC组织标本6份，非chRCC组织标本23份；GSE26574数据集中chRCC组织标本10份，非chRCC组织标本8份；TCGA-GTEx数据集中chRCC组织标本65份，非chRCC组织标本113份。相关数据集获取流程图见图1。

图1 数据集获取流程图

2.2chRCC组织与非chRCC组织中CLDN8表达水平比较 chRCC组织CLDN8 mRNA表达水平高于非chRCC组织，但仅在TCGA-GTEx数据集中差异有统计学意义(P<0.05)。见图2A～D。免疫组化结果显示，与非chRCC组织比较，chRCC组织细胞成片排列，无明显结构，细胞体积增大，核大深染，CLDN8蛋白定位于细胞浆，在chRCC组织中呈强阳性表达。见图3～4。chRCC组织CLDN8蛋白表达水平与非chRCC组织比较，差异有统计学意义(P<0.000 1)。见图5。

A～D.基于公共数据集的CLDN8 mRNA表达水平比较。

A.肾小管；B.肾小球。

A.肾小管；B.肾小球。

图5 基于In-house TMA数据集的CLDN8蛋白表达水平比较

2.3数据集分析结果 各数据集存在显著异质性(I2=82.4%，P<0.000 1),采用随机效应模型分析。GSE11151、GSE15641、GSE26574、TCGA-GTEx、In-house TMA数据集SMD分别为1.27(95%CI：-0.21～2.74)、0.41(95%CI：-0.50～1.31)、0.46(95%CI：-0.48～1.40)、1.01(95%CI：0.69～1.33)、4.12(95%CI：2.74～5.49)。5个数据集合并SMD为1.33(95%CI：0.39～2.27)。Deeks′漏斗图和Egger′s检验显示，各数据集不存在发表偏倚(P>0.05)。见图6。CLDN8诊断chRCC的sROC曲线AUC为0.93(95%CI：0.90～0.95)，灵敏度为0.86(95%CI：0.70～0.94)，特异度为0.87(95%CI：0.71～0.95)，阳性似然比为6.78(95%CI：2.53～18.15)，阴性似然比为0.17(95%CI：0.07～0.39)。见图7、表1。

表1 各数据集灵敏度、特异度、阳性和阴性似然比

续表1 各数据集灵敏度、特异度、阳性和阴性似然比

A.Deeks′漏斗图；B.Egger′s漏斗图。

A～E.不同数据集的ROC曲线；F.sROC曲线(①为GSE11151，②为GSE15641，③为GSE26574，④为TCGA-GTEx，⑤为In-house TMA)。

3 讨 论

chRCC是常见的肾肿瘤亚型，约占肾肿瘤患者的5%[14]，目前临床仍以病理学诊断方法确诊。随着测序技术及分子靶向治疗的发展，生物学标记物成为当前临床诊断的发展方向。CLDN8在构建细胞紧密连接、维持细胞屏障功能、细胞间分子传递过程中发挥重要作用，近年来被认为与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[15]。本研究不仅从mRNA水平分析了CLDN8在chRCC中的表达水平，而且验证了CLDN8蛋白的异常表达。

共85例chRCC样本和149例对照样本的mRNA测序数据用于检测CLDN8在转录组水平的表达差异，11例chRCC样本与16例对照样本用于CLDN8蛋白验证。本研究结果显示，TCGA-GTEx、In-house TMA数据集中CLDN8在chRCC组织中具有显著上调趋势(P<0.000 1)，GSE11151、GSE15641、GSE26574 3个数据集中CLDN8表达上调差异不显著，其原因可能是样本量不足所致。本研究结果显示，CLDN8诊断chRCC的sROC曲线AUC为0.93，灵敏度为0.86，特异度为0.87，阳性似然比为6.78，阴性似然比为0.17。提示对于chRCC，CLDN8具有较高的诊断效能。已有研究证明，CLDN8上调与多种恶性肿瘤相关，其在结直肠癌中高表达，可能通过MAPK/ERK信号通路促进结直肠癌的发生、发展[10]。ASHIKARI等[9]研究认为，CLDN8是雄激素调节基因，可促进前列腺癌细胞的增生和转移。此外，miR-361-5p通过靶向抑制CLDN8的表达可抑制视网膜母细胞瘤[16]。本研究结果显示，CLDN8在chRCC中呈异常高表达趋势，但其具体机制未知。提示，CLDN8在chRCC中上调，可能参与了chRCC的发展进程。

综上所述，CLDN8高表达可能与chRCC形成与进展相关。本研究存在一定局限性：如纳入样本数不多、异质性来源不清楚、没有明确揭示CLDN8参与chRCC的机制。未来需要更多的研究来揭示CLDN8在chRCC中异常高表达的分子机制。