裴宇盛，陈 晨，蔡 彤，陈丹丹，高 华

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒是一种新型快速止血、消除炎症的医疗器械。研究表明[1-2]，常见的纳米类成分能够改善免疫细胞脱颗粒状态，其抗炎机制可能与抑制机体肥大细胞功能活化，降低组胺及炎症因子等相关介质的释放有关，在病理上表现出对模型动物的保护作用。而本纳米颗粒是以医用高分子特异亲和吸附材料为基础，合成制备的具有“双亲性”的皂化醋酸乙烯酯/二乙烯基苯(saponification vinyl acetate/divinylbenzene，简称SVD)球状颗粒共聚物骨架并固载分子手臂，以该高交联低密度材料作为充填物，研发出的血液灌流器及口服胶囊剂型吸附材料，能够特异性高效地清除高内毒素血症患者血液内或肠源性的内毒素，以阻断内毒素血症的恶化。本课题组针对改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒对细菌内毒素的吸附能力开展研究，为其质量控制和和临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1材料 改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒(2021101301)由天津市权阳医疗器械有限公司提供；动态显色法鲎试剂(2106090)购自湛江安度斯生物有限公司；细菌内毒素检查用水(1810260)购自湛江安度斯生物有限公司；细菌内毒素国家标准品(150800-201601)由中国食品药品检定研究院提供；无水乙醇(20210121)购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠注射液(2012023104)购自石家庄四药有限公司。

1.1.2仪器 Multireax型旋涡混合器(德国Heidolph)；ELx808型内毒素检测仪(美国Biotek公司)。

1.2 方法

1.2.1纳米材料的预处理 称取纳米结构颗粒1.0 g，置于50 mL无热原的离心管中。加入10 mL无水乙醇，缓慢摇匀，浸泡10 min，用20 mL生理盐水冲洗弃去液体，共洗5次。最后1次冲洗后、离心、去上清液，备用。

1.2.2内毒素的吸附 在离心管中加入用内毒素检查用水制备的2 000 EU·L-1的内毒素标准品溶液10 mL，将离心管放入恒温水浴振荡器内，以(90±10)r·min-1的速率，(37 ±1)℃恒温振荡吸附2 h。

1.2.3标准曲线的建立及验证 取细菌内毒素国家标准品，使用检查用水复溶、稀释，复溶时使用1 mL检查用水，在旋涡混合器上混合15 min，将细菌内毒素溶液稀释至浓度为104、103、102、10 EU·L-1，每步稀释都应在混合器上混匀30 s，所得的4个浓度的标准细菌内毒素溶液每一浓度平行2孔加入到内毒素检测反应酶标板中，每孔加样体积为0.1 mL，即为标准曲线所需溶液；另在2孔中分别加入0.1 mL检查用水，作为阴性对照；然后每孔均加入0.1 mL已复溶好的动态显色法鲎试剂，放入酶标仪在405 nm处进行动力学检测，检测间隔30 s，检测持续时间90 min。进行3次试验，记录每一浓度的响应值(Onset OD值)，并与阴性对照进行比较。

1.2.4改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒对内毒素吸附力试验 使用1.2.3中的细菌内毒素标准溶液，以及1.2.2制备的取吸附后的所得溶液，根据2020版《中国药典》通则1143中规定的光度法进行吸附后液体中的内毒素含量检测。

1.2.5吸附率计算 按以下公式计算吸附率。

吸附率/% =(吸附前内毒素浓度-吸附后内毒素浓度)÷吸附前内毒素浓度×100 %。

2 结果

2.1标准曲线的建立及验证结果3次试验的结果的阴性对照的反应时间均大于标准曲线最低点浓度10 EU·L-1的反应时间。将仪器所测结果，进行双对数转化并采用线性拟合，标准曲线方程拟合结果见Tab 1。标准曲线结果符合规定。

Tab 1 Results of standard curve parameters

2.2 改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒对内毒素的吸附率纳米颗粒在重量体积比(W/V)为10 kg·L-1的情况下，经过预处理、吸附后，可将2 000 EU·L-1的细菌内毒素标准溶液吸附至内毒素含量小于10 EU·L-1，计算吸附率数值为大于99.5%。

3 讨论

细菌内毒素作为最常见的强力炎性诱导剂，通过被体液中的免疫细胞TLR4受体识别后，进而使免疫细胞分泌多种细胞因子，引起炎症反应[3-6]。在严重创伤、感染等应激状态下可出现全身网状内皮系统功能障碍，免疫机能下降，肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力等情况。胃肠道粘膜缺血、坏死、屏障破坏，大量内毒素释放入血，肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环，或者某些组织、器官的感染也会引起外源性内毒素入血[7]。以上情况都会引发严重的内毒素血症。改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒是通过吸附内毒素的方法，高效清除患者体内的内毒素，因此，本课题组开展了针对其内毒素吸附能力的研究。采用经典的细菌内毒素检查法—鲎试验法，使用纳米材料吸附内毒素，考察评价纳米材料对内毒素的吸附能力。实验结果显示，改性苯乙烯二乙烯基苯亲和树脂纳米结构颗粒对于细菌内毒素有高达99.5%以上的吸附力，提示该纳米结构颗粒能够有效吸附内毒素从而发挥药理活性。纳米结构颗粒对内毒素吸附的机制，可能与纳米粒子的电性有关，对此我们将作进一步研究。