文/吴斌

本文在构建罗非鱼无乳链球菌病亚单位疫苗基因工程菌的基础上，针对中试生产环节，进一步开展基因工程菌高密度发酵及目标蛋白提取条件的研究，从发酵培养基的筛选、诱导剂的使用剂量、诱导时间，以及目标蛋白提取与纯化等方面优化工艺条件，以实现基因工程菌高密度培养和获得较高目标产物浓度的目的，进一步节约疫苗生产成本并提高产出效率，解决规模化生产决定性环节的问题，为基因工程疫苗走向产业化奠定基础。

无乳链球菌是革兰氏阳性菌，可感染包括罗非鱼在内的多种淡水养殖鱼类。2009年至今，我国罗非鱼养殖业受到无乳链球菌病影响严重。无乳链球菌具有多种血清型，多发于春、夏和秋季，流行高峰为5月～9月，幼鱼和成鱼均可发病，传染性强，发病率达20%～30%，病鱼死亡率高达25%～80%。目前罗非鱼无乳链球菌病尚无有效控制手段，研发无乳链球菌病基因工程亚单位疫苗成为防控该病重要的研究方向。

SIP蛋白是一种B族链球菌的表面免疫性蛋白，是无乳链球菌疫苗抗原的重要候选蛋白。通过构建原核表达体系，可获得具有免疫原性和保护特性的重组蛋白SIP。

本文针对已研发的罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗，在所构建的罗非鱼无乳链球菌疫苗SIP工程菌SIPpET32a基础上，对重组基因工程菌高密度发酵、SIP蛋白表达和分离纯化的条件进行优化，以完善重组大肠杆菌高密度发酵和目标蛋白有效提取的工艺技术，为经济、高效生产SIP重组蛋白建立基础，并对促进罗非鱼无乳链球菌基因工程SIP微胶囊口服疫苗的产业化起到积极推动作用。

一、材料与方法

（一）材料

1.供试菌株及来源

罗非鱼无乳链球菌SIP原核表达工程菌SIP-pET32a为含SIP蛋白基因的大肠杆菌工程菌E.coliBL21（DE3），具有氨苄青霉素抗性，由福建省淡水水产研究所水产动物病害防治研究室构建并保存。

2.主要培养基

发酵试验用LB、Th、TB、YE、308培养基，成分见表1。

表1 不同培养基每升的成分组成

10L发酵罐培养均为308培养基按比例配制，微量元素见表2。

表2 微量元素母液组成

发酵罐补料培养基：300g/L酵母粉、600g/L葡萄糖、24g/L MgSO4·7H2O。其中葡萄糖和MgSO4·7H2O需要单独灭菌115℃，20min，pH7.2。

3.SDS-PAGE电泳储液

电泳储液按照蛋白质技术手册配制。

（二）方法

1.种子菌体的活化

将在15%甘油保存的SIP基因工程菌SIP-pET32a菌种，涂布于LB琼脂平板获得单菌落。挑取单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37℃、120r/min摇床培养。

2.SIP基因工程菌SIP-pET32a发酵培养基的筛选

以1%的接种量分别接种在LB、Th、TB、YE、308培养基中，30℃摇瓶培养，每2h取样，测定菌株生长曲线。菌体生长一定时间后，用IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，测算出SIP蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的百分比。

3.不同诱导剂量和诱导时间对工程菌表达SIP蛋白的影响

使用本试验优化的培养基，30℃摇瓶培养，根据SIP基因工程菌SIPpET32a菌株生长曲线，于菌体对数生长中期，加入终浓度为0.5mmol/L和1.0mmol/L的IPTG诱导剂诱导蛋白表达，分别于诱导表达4h、5h和6h时取样，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，测算出SIP蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的百分比。

4.SDS-PAGE分析

发酵结束后，4℃，5000r/min离心收集菌体。在PBS缓冲液中超声破碎菌体，破碎液与上样缓冲液混合后进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后脱色，扫描蛋白电泳胶后，用Quantity One软件进行灰度分析，根据灰度测算出SIP蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的百分比。

5.高密度发酵

高密度发酵采用10L发酵罐，发酵初始培养基体积6L，设置培养基pH7.0，使用25%氨水自动调节。通过转速关联控制溶氧在20%以上。当葡萄糖消耗完溶氧迅速上升时，指数流加补料。根据下列公式计算补料体积，设定不同的比生长速率（μset）为0.05h-1、0.08h-1和0.10h-1，采用每1h改变补料体积的阶梯式补料方式。

其中，F为流加率（L/h），X（t0）和V（t0）为补料开始前细胞浓度（细胞干重g/L）和发酵液体积（L），SF为补料培养基葡萄糖的浓度（g/L），m为保持系数（g·g/h）-0.025，YX/S为产出系数（g/g），即每克葡萄糖产生多少克细胞干重，通过以下公式计算。

其中，ODb为补料开始前发酵液的OD600值，OD0为发酵开始时的OD600值，0.54为1OD600相当于1L发酵液中含有的细胞干重为0.54g，Vm为发酵合成培养基的初始体积（L），Vi为发酵种子液的体积，Vs为取样体积（L），S为合成培养基中含有的葡萄糖的总量（g）。当OD600达到60.0左右时，加入IPTG，终浓度为1mmol/L，诱导SIP蛋白的表达，补料体积根据计算F的公式进行计算，μset分别为0.05、0.08和0.10，每1h改变一次补料流加率F，诱导5h。

6.细胞破碎渗透休克方法提取SIP蛋白

在4℃，6000r/min条件下离心收集菌体，弃上清，将100mL菌体悬浮于适量冷渗透休克1#溶液中（20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA，蔗糖），其中1#溶液中蔗糖浓度分别设置5%、10%、20%；溶解至菌体密度OD600约为2.0，冰水浴，10min。离心，弃去上清，菌体悬浮于等量的冷渗透休克2#溶液中（20mmol/L Tris，pH8.0，5mmol/L EDTA），冰水浴，10min。4℃，10000r/min离心15min，取上清，-20℃冻存待测。

7.渗透休克法提取SIP蛋白条件的优化

渗透休克法中，影响SIP蛋白释放效果比较大的三个因素为：细胞浓度、处理时间和EDTA浓度。选择影响SIP蛋白提取效果各因素中有意义的水平进行正交实验，以基因工程菌100mL发酵液为处理对象，确定最佳提取条件。正交实验的因素水平见表3。

表3 因素水平表

8.SIP蛋白提取放大试验

优化确定渗透休克提取SIP蛋白的最佳条件后，对提取规模进行放大，从每次处理基因工程菌发酵液100mL提升到10L。分析SIP蛋白提取效果。

9.蛋白质浓度测定

总蛋白含量测定：Bradford法。

二、结果与分析

（一）工程菌发酵培养基和发酵条件的优化

1.SIP基因工程菌SIP-pET32a发酵培养基的筛选

选取5种可用于基因工程菌SIP-pET32a发酵使用的培养基，针对本研究构建菌株进行摇瓶培养，绘制生长曲线。从图1可以看出，LB作为基因工程最常使用的培养基但并非本工程菌最适宜生长的培养基。TB培养基以高浓度的酵母粉和蛋白胨作为主要成分，并以磷酸盐作为缓冲体系，有利于本菌株的生长，到24h后菌体量仍在增长。Th培养基中胰蛋白胨和酵母粉的含量是TB的十分之一，不利于菌的后期增殖。YE培养基以酵母粉为氮源，以甘油为碳源，与TB培养基相比，缺少磷酸盐，培养菌的后期生长速率明显减缓。308培养基是以普通的葡萄糖作为碳源，培养菌株生长快速进入对数生长期，12h后就进入稳定期，说明以葡萄糖作为碳源，以酵母粉为氮源很适合本工程菌的生长。从SIP蛋白表达量的结果可见，在培养10h时诱导4h，单位细胞SIP蛋白表达量无显著性差异（见图2）。虽然TB培养基也适合本菌株的生长，但其培养基组分用量大、价格高，单位成本远远高于308培养基，因此后续研究和生产以308培养基为基础培养基。

图1 工程菌在不同培养基中的生长情况

图2 不同培养基中SIP蛋白的表达量

2.不同诱导时间和诱导剂量对工程菌表达SIP蛋白的影响

诱导时间和诱导剂添加量是工程菌发酵过程中重要的控制参数。308培养基培养SIP基因工程菌SIP-pET32a 5h，分别加入0.5mmol/L和1.0mmol/L诱导剂，表4显示，加入2种浓度诱导剂后5h，目标蛋白表达量均达到最高，时间延长单位细胞蛋白表达不再增加。从IPTG的添加量可以看出，1.0mmol/L的IPTG更有利于SIP蛋白的诱导表达。

表4 不同诱导时间对SIP蛋白表达的影响

（二）10L发酵罐工程菌高密度发酵策略的优化

从图3的发酵曲线显示，当设定细胞比生长速率为0.05h-1时，补料后细胞生长较缓慢，生长周期长，OD600达到60的时间比μ值设定为0.08h-1时推迟了3h，说明补料的速度可以加大，当μset设定到0.10h-1时，补料速度过快，发酵过程中，氧气供应遇到困难，反而出现细胞生长没有0.08h-1时快的现象。从实验结果可以确定，当μset为0.08h-1时，能快速得到高密度工程菌细胞，18h结束发酵时，细胞量达到干重36.4g/L。从图4可以看出在高密度条件下，SIP蛋白仍能得到高效表达，SIP蛋白表达量占可溶性蛋白的20.6%。

图3 工程菌指数补料高密度发酵曲线

图4 补料发酵中比生长速率设定值对SIP蛋白表达的影响

（三）SIP蛋白的提取与纯化

1.细胞破碎渗透休克法对SIP蛋白释放的影响

基因工程菌表达蛋白的分离纯化一直是困扰产品应用的重要瓶颈，有效地破碎细胞释放融合蛋白是其中的第一步。通过渗透休克的方法处理工程菌细胞，结果如图5所示，较低渗透压下，SIP蛋白释放量很少，当蔗糖浓度达到20%，大部分SIP蛋白得到有效释放，并且SIP蛋白占可溶性蛋白的70%以上。该方法可应用于基因工程菌的SIP蛋白分离、提取与纯化。

图5 渗透休克对细胞释放SIP蛋白的影响

2.渗透休克法提取SIP蛋白条件的优化

细胞浓度、处理时间和EDTA浓度对SIP蛋白释放的影响比较大，正交实验结果见表5。在各个因素分析中，相对于总蛋白浓度，处理时间和细胞浓度的R最大，对总蛋白提取的影响也相对较大，各因素对总蛋白提取影响的次序为：处理时间>细胞浓度＞EDTA浓度。最佳提取工艺条件为A3B2C3，即细胞浓度OD600=20，EDTA浓度为10mM，处理1h。相对SIP蛋白比例，影响最大的是EDTA浓度，各因素影响SIP蛋白比例的次序为：EDTA浓度>细胞浓度>处理时间。最佳提取工艺条件为：细胞浓度OD600=10，EDTA浓度为20mM，处理0.5h。

表5 正交实验结果

3.SIP蛋白提取放大试验

确定应用优化条件后的渗透休克法提取SIP蛋白，每次处理基因工程菌发酵液10L。4个批次均有效获得SIP蛋白，SIP蛋白占总蛋白的比例大于78.2%（见表6）。

表6 SIP蛋白提取试验

三、讨论

（一）发酵培养基的选择

基因工程菌是基因工程生产抗体、疫苗等高价值产品的重要基础。工程菌对外源基因的表达会受到各种因素的影响，这些因素主要有：培养基的组成、诱导剂的种类、诱导的时机、诱导的时间、诱导的浓度、诱导的温度和溶氧情况等。本研究结果表明，以葡萄糖为碳源的308培养基最有利于菌株的生长和SIP蛋白的表达。其中很重要的一个因素是在培养基中加入了几类微量元素和无机盐。这些微量元素和无机盐除了为大肠杆菌SIPpET32a的生长提供足够的营养，还能稳定菌体的生长环境，如加入磷酸盐中的磷酸根可以保持菌体生长过程中pH的稳定，钾离子可以维持细胞渗透压的平衡。

（二）基因工程菌高密度发酵条件优化

为了得到大量的SIP蛋白，需要对发酵的规模进行放大，并且实现工程菌高密度发酵。在实践中，通常要先在小型发酵罐中摸索高密度发酵的条件。本研究采用10L发酵罐对高密度发酵的策略进行优化，根据工程菌生长和底物消耗的特性，采取了指数补料策略，成功实现了在小型发酵罐中较短时间内使细胞量达到高密度的结果，并且不影响SIP蛋白的表达量。

经过培养基和培养条件的优化，本研究对象工程菌SIP-pET32a在含葡萄糖的308培养基中，30℃发酵，在对数生长中期用1.0mmol/L IPTG诱导5h，最有利于SIP蛋白的表达。在10L发酵罐中采用指数补料发酵，当μset为0.08h-1时，发酵18h后菌体干重和SIP蛋白表达量分别达到36.4g/L和20.6%，实现了工程菌高密度发酵和蛋白质的有效表达，为SIP蛋白的规模化应用奠定了基础。

（三）基因工程重组蛋白SIP的提取与纯化

重组蛋白的提取与纯化是工程菌生产中重要的一环。本研究中基因工程菌SIP-pET32a产生的SIP蛋白主要在周质空间，采用渗透休克法不仅简便易行，还有可能对目标蛋白进行选择性释放。因此对渗透休克法释放SIP蛋白的条件进行了优化，在细胞浓度OD600=10、EDTA浓度为20mM、处理0.5h时可得到较佳的效果。放大到10L的规模提取SIP蛋白，发现在高渗溶液处理后转移到低渗溶液时，细胞容易聚集成团，影响蛋白的释放。通过改变转移方法，边匀浆搅拌边转移，增加稀释液体积，分批次转移，再通过分子量10kDa的超滤膜进行蛋白质浓缩，可更好地获得SIP蛋白。4个批次试验结果均能有效获得SIP蛋白，SIP蛋白占总蛋白的比例大于78.2%。用渗透休克法提取SIP蛋白快速、简便、有效。