张文静,徐新禹

(1. 朝阳市中心医院，辽宁 朝阳 122000;2. 四川大学华西临床医学院，四川 成都 610000)

糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一，也是引起糖尿病患者死亡的重要原因之一。该病发病特点是肾小球血管受损、硬化，临床以尿蛋白排泄量增加为主要特征，其治疗主要是基于血压和血糖的控制，尚无有效的治疗策略[1-2]。目前研究认为，氧化应激、炎症反应、糖脂代谢功能障碍、血流动力学异常及细胞凋亡等多种因素参与糖尿病肾病的发生和发展，其中肾组织的持续炎症反应及高糖引起的肾组织细胞凋亡是糖尿病肾病发展的重要病理生理基础[3-5]。因此，探究糖尿病肾病肾组织炎症及细胞凋亡的发生机制，对于防治糖尿病肾病具有重要的临床意义。绿原酸是一种中草药提取物，主要存在于金银花、山楂、杜仲和菊花等中药中，已被证明具有显著的抗炎、抗氧化、抗菌和免疫调节作用[6-7]。朱超等[8]报道，绿原酸可通过抑制内质网应激反应而减轻糖尿病氧化性肾损伤，对糖尿病肾病具有一定治疗作用。本研究旨在观察绿原酸对糖尿病肾病大鼠肾功能、肾组织炎症和细胞凋亡的影响，并探讨其可能作用机制，为寻找绿原酸治疗糖尿病肾病的作用靶点提供实验基础。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠60只， 8周龄，体重(220±30 )g，购自大连医科大学，动物合格证号：SCXK(辽)2018-0003。在室温(23±2)℃、相对湿度50%～70 %、自然光照环境中饲养。动物处置符合相关伦理要求。

1.2试剂 绿原酸(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；链脲佐菌素[STZ，纯度≥98 %，翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；过碘酸-雪夫氏(PAS)染色试剂盒、HE染色试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、RIPA缓冲液、BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白定量、空腹血糖(FPG)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；兔抗B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、淋巴细胞瘤-2相关蛋白X(Bax)、Cleaved-caspase-3、Toll样受体4(TLR4)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、IκBα、p-IκBα抗体和鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗鼠IgG(美国Abcam公司)。

1.3实验方法 60只大鼠饲养1周适应环境后，随机分为正常组、模型组、绿原酸低剂量组、绿原酸中剂量组、绿原酸高剂量组、二甲双胍组，每组10只。除正常组腹腔注射柠檬酸钠缓冲液外，其他各组大鼠腹腔注射50 mg/kg STZ(柠檬酸钠缓冲液稀释)建立糖尿病模型，连续注射5 d，最后一次注射72 h后采用尾静脉针刺取血的方法检测大鼠FPG水平，FPG>11.1 mmol/L表示糖尿病模型建立成功。此后定期检测大鼠FPG和24 h尿蛋白，持续出现蛋白尿的大鼠为糖尿病肾病造模成功。造模成功后第2天，绿原酸低、中、高剂量组大鼠分别灌胃30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg 的绿原酸，二甲双胍组大鼠灌胃200 mg/kg的二甲双胍，正常组和模型组大鼠灌胃同等剂量的生理盐水，均1次/d，连续灌胃8周。

1.4检测指标及方法

1.4.1肾功能指标和FPG水平 末次灌胃12 h后，收集大鼠24 h尿液用于检测24 h 尿蛋白定量；采集大鼠眼球血，以3 000 r/min离心10min，分离血清，保存于-20 ℃冰箱，采用全自动生化分析仪检测SCr和BUN水平，血糖仪检测FPG。

1.4.2肾组织HE染色病理形态 采血结束后处死大鼠，取肾组织，用预冷的生理盐水洗涤，将左肾置于4 %多聚甲醛中固定24 h，依次蒸馏水浸泡、石蜡包埋、二甲苯透明、梯度酒精脱水，制成5 μm厚度的石蜡切片，取石蜡切片进行脱蜡、水化，用苏木精染色5 min，PBS洗涤后，在1%盐酸酒精中分化，伊红溶液中染色30 s，梯度酒精脱水，透明处理后，中性树胶密封，在光学显微镜下观察组织病理变化。

1.4.3肾组织PAS染色形态 取大鼠肾组织石蜡切片，二甲苯脱蜡、蒸馏水冲洗，1.5%高碘酸处理25 min，用蒸馏水反复洗涤，PAS染色30 min，流水冲洗至显出红色，苏木素复染5 min，流水冲洗，脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察染色结果，PAS染色阳性显示为紫红色，细胞核呈蓝色。

1.4.4血清炎症因子水平 -20 ℃冰箱中取出各组大鼠血清，严格参照大鼠ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.4.5肾组织细胞凋亡情况 取大鼠肾组织石蜡切片，常规脱蜡、脱水，按照试剂盒说明书进行TUNEL染色，光学显微镜下观察细胞凋亡情况，凋亡细胞呈褐色，计算细胞凋亡指数(AI)。AI=凋亡细胞数目/细胞总数目×100%。

1.4.6肾组织中凋亡蛋白和TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 采用Western blot 法检测：取-80 ℃保存的大鼠右肾组织，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解提取总蛋白质，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，取定量蛋白上样至SDS-PAGE凝胶电泳上，分离后转移至PVDF膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后，将膜与1∶1 000比例稀释的一抗(TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3和β-actin)在4 ℃条件下孵育过夜，洗涤膜后，将膜与HRP结合的二抗在室温下孵育2 h，使用增强的化学发光试剂显影，以生物光谱凝胶成像系统分析图像，β-actin作为内参蛋白对照条带进行标准化目的蛋白。

2 结 果

2.1各组大鼠肾功能指标和FPG水平比较 模型组大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明显高于正常组(P均<0.05)；绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且绿原酸高剂量组、二甲双胍组各指标水平均明显低于绿原酸低剂量组和绿原酸中剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾功能指标和FPG比较

2.2各组大鼠肾组织病理形态学表现 HE染色和PAS染色显示，正常组大鼠肾小球大小、形态正常，结构完整、清晰，肾小管上皮细胞排列规则，无细胞坏死及炎性细胞浸润；模型组大鼠肾小球体积增大，基底膜扩张增厚，肾小管结构紊乱，发生空泡样变性，存在较多炎性细胞浸润；与模型组比较，绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠肾小球体积减小，肾小球基底膜增厚和肾小管空泡样变性得到不同程度改善，炎性细胞浸润减少，其中绿原酸高剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织病理改变更轻。见图1。

图1 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织病理形态学表现

2.3各组大鼠血清炎症因子水平比较 模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显高于正常组(P均<0.05)；绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且绿原酸高剂量组和二甲双胍组各指标水平均明显低于绿原酸低剂量组和绿原酸中剂量组(P均<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠肾组织细胞凋亡情况 TUNEL染色显示，模型组大鼠肾组织细胞出现凋亡，AI为(35.61±1.79)%，明显高于正常组的(2.83±0.53)%(P<0.05)；绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织细胞凋亡减少，AI分别为(26.38±1.45)%、(19.47±1.26)%、(10.35±1.02)%、(8.47±0.78)%，均明显低于模型组(P均<0.05)，且绿原酸高剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织细胞凋亡更少，AI均明显低于绿原酸低剂量组和绿原酸中剂量组(P均<0.05)。见图2。

图2 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织细胞凋亡情况(TUNEL染色法，×400)

2.5各组大鼠肾组织凋亡蛋白与TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 与正常组比较，模型组大鼠肾组织中Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相对表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织中Bcl-2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相对表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明显降低(P均<0.05)；与绿原酸低剂量组和绿原酸中剂量组比较，绿原酸高剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织中Bcl-2蛋白相对表达量均更高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相对表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均更低(P均<0.05)。见图3和图4。

图3 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中凋亡蛋白表达情况

图4 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织TLR4/ NF-κB信号通路相关蛋白表达情况

3 讨 论

糖尿病肾病是全球慢性肾病的主要原因，目前临床上尚无治疗该病的有效药物。近年来，随着中医药现代化的快速发展，中医药辨证疗法逐渐应用于糖尿病肾病的治疗，并被证实具有良好的疗效[9]。绿原酸是一种由咖啡酸与奎尼酸形成的苯丙素类物质，属于多种中草药的主要有效成分之一，其具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂、心血管保护等多种生物学效应[10]。Bhandarkar等[11]研究表明绿原酸可减轻大鼠高碳水化合物、高脂肪饮食引起的心血管、肝脏和代谢变化。Liu等[12]研究发现绿原酸能够通过调控氧化应激相关Nrf2通路对脑缺血/再灌注损伤大鼠发挥保护作用。Gao等[13]研究认为绿原酸可通过调节MAPK/ERK/JNK途径改善右旋糖酐钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎。Kong等[14]研究发现绿原酸可通过Sirt1介导的氧化还原和线粒体功能抑制百草枯诱导的细胞凋亡。本实验采用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病肾病大鼠模型，结果显示模型组大鼠FPG水平显著升高，肾功能显著下降，肾脏组织存在明显的损伤和炎性细胞浸润；绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠FPG水平显著降低，肾功能和肾组织损伤明显改善，且绿原酸干预效果随剂量增加而增强。提示绿原酸对糖尿病肾病具有一定的缓解作用，这与其他学者的研究结果相印证[15-16]。

高糖介导的肾脏慢性炎症反应是糖尿病肾病发病机制的重要组成部分，糖尿病肾病发生、发展过程中过度表达的炎症因子也是促进肾纤维化、导致肾衰竭的主要因素[17]。多项研究报道，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子在糖尿病肾病大鼠肾脏中表达增加，而下调上述炎性因子的表达可减轻糖尿病肾病大鼠的炎症反应[18-19]。本实验结果显示，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低。该结果与Bao等[20]研究结果一致，提示绿原酸可通过降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平抑制糖尿病肾病大鼠炎症反应。

细胞凋亡是细胞在分化和发育过程中由多种基因调控发生的自发性死亡方式，能被各种病理因素触发。在糖尿病肾病中，高血糖引发的肾细胞凋亡是糖尿病肾病的主要病理特征，肾细胞凋亡进一步引起肾小管间质纤维化和肾小球硬化[21]。Yi等[22]报道，绿原酸可通过抑制凋亡蛋白Caspase-3蛋白表达及Bax/Bcl-2蛋白的比值抑制玉米赤霉烯酮诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。本实验中，绿原酸各剂量组和二甲双胍组大鼠肾组织细胞凋亡及肾组织中Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表达较模型组明显减少，肾组织中Bcl-2蛋白表达较模型组明显增加，表明绿原酸可通过调控凋亡蛋白表达而抑制肾细胞凋亡。

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系统中一类保守的模式识别受体，在外界病原体刺激下可激活下游炎症信号通路。TLR4是TLRs家族中的重要成员，在炎症反应发生过程中起着关键性作用。NF-κB作为TLR4信号通路的下游效应因子，在正常生理条件下以无活性的NF-κB p65和p50等构成的异源二聚体与抑制性蛋白IκBα结合，而在病理条件下，IκB激酶能够使IκBα特异磷酸化，促使NF-κB p65转移至细胞核中，导致机体释放炎症因子而引发炎症反应。有研究报道，TLR4/NF-κB信号通路在急性肾损伤、慢性肾脏疾病中发挥重要作用[23-24]。Ye等[25]研究提示，绿原酸能够通过抑制TLR4/NF-κB通路减轻脂多糖诱导的急性肾损伤。本实验结果显示，绿原酸和二甲双胍可有效下调糖尿病肾病大鼠肾组织中TLR4蛋白表达，抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化。提示绿原酸可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路保护糖尿病肾病大鼠肾功能。

综上所述，绿原酸可通过减轻肾组织炎症和调控凋亡蛋白表达而抑制肾细胞凋亡，保护糖尿病肾病大鼠肾功能，其内在机制可能与调控TLR4/NF-κB信号通路有关，为绿原酸治疗糖尿病肾病提供了新的潜在靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。