孟凡艳，王 旭，吴桐忠，张星星，韩猛立，张 倩，钟发钢，张满义，张乾义，胡建军，黄 新

（1.新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 832000；2.塔里木大学 动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300；3.新疆方牧生物科技有限公司，新疆 图木舒克 843999；4.中国兽医药品监察所，北京 100081）

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起牛肺炎、乳房炎、关节炎、中耳炎、角结膜炎、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病的病原体，也是牛呼吸道疾病综合征（BRDC）的主要参与者［1］。1961年，美国首次从患有乳腺炎的牛乳中分离获得该病原［2］。1983年，陈嘉棣等［3］首次从患有乳房炎的乳样中分离到牛支原体；2008年，辛九庆等［4］首次从患肺炎的犊牛肺脏病料中分离到该病原；2011年，姚永进等［5］经过分离鉴定确定新疆北疆某些奶牛场犊牛出现严重肺炎的病原为牛支原体。牛支原体是导致犊牛呼吸道症状的一种重要病原，牛支原体病的发生和流行，造成了养牛场较高的犊牛死淘率与重大经济损失。

牛支原体侵染犊牛会引起犊牛支气管肺炎、关节炎、角膜结膜炎等疾病，但引起犊牛呼吸系统疾病的报道较多［6-8］。研究表明，牛支原体定殖在犊牛的鼻腔不会导致犊牛发病，当出现断奶、运输、剧烈的天气变化等应激因素导致犊牛免疫力下降时，牛支原体会侵袭犊牛的呼吸系统，引起一系列的临床症状，包括咳嗽、喘、腹式呼吸等［9-10］。为了解病原携带状态的犊牛在整个牛群里所占的比例，我们特地选取了石河子地区集约化奶牛场无临床症状犊牛的鼻拭子样品，使用PCR技术检测犊牛的感染状态，并通过分离鉴定进一步确定，为更好地预防犊牛支原体感染提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2020年9月，石河子地区某规模化奶牛场2月龄犊牛发生以呼吸道症状为主的疫病，发病率为30%，病死率为40%～50%。采取2头发病犊牛的肺脏组织，并对该场2月龄犊牛进行鼻拭子样品采集，所有的样品运送到实验室并置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器 PCR Super Mix、DL2000 DNA Marker，北京全式金生物技术股份有限公司产品；DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，天根生化科技(北京）有限公司产品；PPLO肉汤、PPLO琼脂、生化鉴定试管，青岛海博生物技术有限公司产品；丙酮酸钠、氨苄青霉素钠，北京索莱宝科技有限公司产品；CO2培养箱，eppendorf公司产品；体视显微镜，Leica公司产品；PCR仪，ABI公司产品；电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2 检测方法与过程

1.2.1 临床症状观察及剖检记录 2头发病犊牛的肺脏组织表面出现大小不一的结节状突起以及不同程度的出血和肉变；采集的鼻拭子样品中有15.56% (7/45）的犊牛表现出呼吸道症状，包括咳嗽、脓鼻涕、呼吸音异常、发热等。

1.2.2 样品的PCR检测 对所采集的样品，根据DNA提取试剂盒说明书提取样品基因组DNA。以样品基因组DNA为模板，参照Pinnow等［11］使用套式PCR方法扩增牛支原体的oppD/F基因，一 轮PCR扩 增 引 物 序 列 为：5′-TTTTAGCTCTT TTTGAACAAAT-3′，5′-GGCTCTCATTAAGAA TGTC-3′；二轮PCR扩增引物序列为：5′-CCAG CTCACCCTTATACATGAGCGC-3′，5′-TGACTC ACCAATTAGACCGACTATTTCAC-3′。

预计扩增片段为442 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，48 ℃/55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s/30 s，进行20个/35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，将阳性产物送至安徽通用生物工程有限公司进行测序。

1.2.3 病料接种培养 将泡过肺脏病料与鼻拭子的上清使用0.22 μm滤膜过滤，吸取300 μL滤液至分装好的3 mL PPLO肉汤中，混匀标记为L1，将其置于5 %CO2恒温培养箱中37 ℃培养3 d。选择液体颜色由红色变为黄色的培养液，连续传代2次。液体传代完成后，取适量菌液进行10倍梯度稀释，连续稀释3次；取200 μL稀释的菌液滴加至PPLO固体培养基中央，不断旋转平板使菌液在琼脂上方均匀扩散，标记为固体S1代，将固体S1放入CO2培养箱中，倒置培养3～5 d。待培养基长出针尖大小的菌落时，在显微镜下观察菌落的形态特征；挑取典型的“煎蛋样”菌落接种于固体培养基，纯化3次后，于-80 ℃甘油中保存纯化完成的菌株。

1.2.4 Dienes染色 参照吴移谋等［12］的方法，先将Dienes染液用超纯水稀释10倍，然后覆盖于支原体培养的固体培养基表面上，染色1 min后，用超纯水洗去染液，在显微镜下观察支原体菌落中心的颜色；如果菌落中心能明显着色且呈现深蓝色，则为支原体菌落。

1.2.5 生化试验 参照陆承平［13］的方法，根据生化试管说明书，选择葡萄糖发酵、精氨酸水解及甘露醇发酵等试验进行操作。

1.2.6 菌株的PCR鉴定 纯化后的菌液使用基因组DNA提取试剂盒提取分离株的基因组DNA。以国际标准株PG45的基因序列为模板，使用软件primer 5.0设计PCR引物，扩增牛支原体16S rRNA基 因，引 物 序 列：5′-GCGAAGGCAGCTAACTG GGCAT-3′、5′-CTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTC-3′，预计扩增片段大小为429 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系20 μL：Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，将阳性产物送至安徽通用生物工程有限公司进行测序。使用MEGA 6.0软件，构建牛羊源支原体属常见菌株16S rRNA序列的遗传进化树，进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

使用牛支原体oppD/F基因对2份肺脏样品进行检测，均为PCR阳性；对45份鼻拭子样品进行检测，PCR总阳性率为51.11% (23/45）。将阳性结果与临床症状相结合发现，具有呼吸道症状的犊牛阳性率为28.57% (2/7），无临床表现的犊牛阳性率为55.26% (21/38）（表1）。

表1 鼻拭子样品检测结果

2.2 分离培养结果

对PCR鉴定为阳性的肺脏病料与鼻拭子样品进行分离培养，共获得了3株病原菌，均来自鼻拭子样品，其中1株来自出现呼吸道症状的犊牛，2株来自无症状的犊牛，分别命名为Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03；使用王展慧等［14］的改良Thiaucourt’s固体培养基培养3 d后，在光学显微镜下观察，分离物与牛支原体典型菌落形态一致，呈“煎蛋样”（图1）。

图1 分离株的菌落形态（40×）

2.3 Dienes染色

分离株经Dienes染色后，菌落中心呈深蓝色，而边缘形成浅蓝色的透明圈，且30 min内不褪色（图2），与牛支原体特征性菌落着色相符。

图2 分离株Dienes染色结果（63×）

2.4 生化试验结果

由表2可知，Mb-SHZ01、Mb-SHZ02、Mb-SHZ03均不发酵葡萄糖，不分解甘露醇，不能水解精氨酸，符合牛支原体的生化试验特征。

表2 生化鉴定结果

2.5 PCR鉴定结果

以分离株基因组DNA为模板，以牛支原体16S rRNA通用引物扩增，出现429 bp左右的条带（图3），与预期的目的条带大小相符。

图3 分离株16S rRNA引物PCR扩增结果

将牛支原体16S rRNA引物PCR扩增产物测序结果在Gen Bank中进行BLAST比对，发现分离株与牛支原体国际菌株NADC59(CP042939.1）的同源性最高，同源性均高达99.25%以上。使用Mega 6.0软件，运用Neighbor-joining法，对分离株与牛羊源支原体属常见菌株的16S rRNA序列构建进化树（图4）。从图4中可以看出：分离株与牛支原体聚在同一分支；精氨酸支原体、关节炎支原体、牛眼支原体、绵羊肺炎支原体、殊异支原体亲缘关系较近；山羊支原体与丝状支原体位于同一分支；进一步证明了分离株为牛支原体。

图4 分离株与其他支原体16S rRNA序列的遗传进化树

3 讨论

牛支原体病常见的诊断方法有血清学诊断、分子生物学诊断、分离培养等。选择PCR检测鼻拭子样品的原因是在动物个体水平上，PCR技术可以检测到间接排菌的现象［15］。oppD/F基因是牛支原体的1种特异性基因，检测临床样品中的牛支原体，敏感性可达5 CFU/mL［16］。本实验使用牛支原体oppD/F基因特异性套式PCR方法检测临床样品，检测结果真实可靠。同时，实验室对呼吸道合胞体病、副流感三型、牛传染性鼻气管炎病毒等进行了PCR检测，均为阴性。

研究结果表明，无症状犊牛牛支原体感染的阳性率高于临床症状明显的犊牛，病原携带状态的犊牛在群体中占有极大的比重，因此要做好犊牛的日常管理工作。共分离到3株病原菌，其中1株来自出现呼吸道症状的犊牛，2株来自无症状的犊牛，2份肺脏组织未分离到牛支原体。这与国外学者近几年的研究结果极为相似，即在没有任何临床异常症状的情况下，从犊牛鼻拭子中分离到了牛支原体，且分离率高达34.3% (12/35）［17］。这与国外早些年的研究结果相反，Gourlay等［18］表示，健康牛几乎不向外界排菌，样本中也很难分离到牛支原体。本实验室未从肺组织样本中分离到牛支原体，可能是由于牛支原体在肺组织中的浓度过低［19］。

本试验共获得3株牛支原体菌株，试验前期牛支原体菌落生长不良，形态过小，无法挑取单个菌落；后期将培养基中葡萄糖和丙酮酸钠的含量由2 g/L提高到4 g/L后，牛支原体生长密度适宜且形态特征明显。可能原因是丙酮酸钠为碳源，碳源充足方可保证牛支原体的生长。因支原体细胞壁缺失，革兰染色着色不良；使用狄氏染色后，中心呈深蓝色，边缘为颜色较浅的透明圈。生化试验结果符合牛支原体的特征。本研究对新疆犊牛支原体肺炎的诊断具有一定的指导作用，为今后开展牛支原体疫苗制备等研究奠定了基础。关于分离株的耐药情况及疫苗制备方面还有待进一步试验研究。