尹竺晟，梁新军

0 引言

热疗作为一种绿色安全的肿瘤治疗手段，目前在临床上常作为放化疗的辅助疗法，其与抗肿瘤免疫机制的基础研究越来越受到重视。近年来，随着众多热疗技术包括射频消融、磁热疗、聚焦超声热疗、腹腔热灌注治疗、纳米颗粒介导的热疗等发展，热疗在临床上的应用也越来越广阔。现将肿瘤热疗与抗肿瘤免疫之间的研究进展作一综述。

1 热疗抗肿瘤机制

热疗是根据肿瘤组织与正常组织对温度的差异应激，对病变部位进行加热，以杀死肿瘤细胞或阻止其生长的一种治疗方法。肿瘤代谢水平普遍较正常组织高，肿瘤血管的异常发育让大多数实体肿瘤组织存在乏氧的情况，在热疗过程中，癌旁组织血流量增加导致肿瘤组织血液供应进一步减少，从而减少了肿瘤所获得的氧以及营养物质，在短时间内提高肿瘤糖酵解代谢水平，使酸性代谢产物大量堆积，从而引起肿瘤细胞自噬[1]。根据温度高低，热疗可分为发热范围温度热疗（39℃～40℃）、中温热疗（热休克温度，41℃～43℃）和热消融（细胞毒性温度，＞43℃）。发热范围温度热疗会增加血流量，从而减少缺氧，而更高的温度则会导致血管损伤，加剧缺氧，也会诱导更直接的肿瘤细胞杀伤[2]。随着技术的进步，目前新开发的热疗手段还包括磁性纳米粒子热疗、低温热疗和光热疗法。

热疗也可以直接或间接杀死缺氧细胞。直接杀伤细胞强烈依赖于加热温度和加热时间；温度越高，加热时间越长，效果越显著。一般而言，低于42℃的温度对细胞几乎没有杀伤作用，除非暴露时间较长[3]。如果细胞保持在缺氧或低pH值状态下，则若温度高于42℃，热疗产生的细胞杀伤效果会更加明显[4]。当温度低于43℃时，细胞凋亡似乎占主导地位，温度更高则以细胞坏死居多。高温可引起DNA双链断裂，这是由于热修复蛋白（如DNA聚合酶）的变性和功能障碍，或变性蛋白沉淀在核染色质结构上，阻止修复酶到达损伤部位[5]。热疗诱导的蛋白质变性也可改变多种依赖核基质的功能（如DNA复制、DNA转录、信使核糖核酸（mRNA）加工和DNA修复）；因此，由热疗诱导的细胞死亡，通过不同的机制，可以促进抗原的呈递或释放，增加将免疫细胞吸引到肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）的信号分子[6]。

2 热疗对免疫微环境与肿瘤细胞的交互影响

热疗可以提高机体自身抗肿瘤免疫水平，其效果不仅可以直接杀死肿瘤细胞，还可以直接或间接激活机体免疫系统。然而，热疗引起抗肿瘤免疫的具体机制尚不完全清楚，国内外已经开展了大量研究，并尝试着从各种视角探讨热疗促进免疫反应的可能机制。

2.1 改变肿瘤细胞免疫原性及能量代谢

有数据支持大多数细胞抑制疗法在癌症患者中诱发继发性坏死的观点，大多数化疗药物和放射线引起癌细胞凋亡而不是原发性坏死[7]。而经热疗后，大量肿瘤细胞坏死，暴露出新的肿瘤相关抗原，刺激免疫系统，进而引起肿瘤细胞的凋亡和继发性坏死。微环境中“能量元件”的成分改变也能影响肿瘤免疫原性的改变。有研究表明高水平的细胞外ATP在肿瘤部位积聚，TME中这些高水平的细胞外ATP通过P2X7受体抑制肿瘤生长，即通过P2X7-NLRP3炎性小体激活以及在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞中发挥P2X7定向的细胞毒性来刺激抗肿瘤免疫反应。热疗能增加细胞膜的膜脂流动性，增加P2X7活性，促进肿瘤细胞死亡，增加肿瘤免疫原性，有利于细胞免疫杀伤肿瘤细胞[8]。

2.2 刺激肿瘤细胞产生热休克蛋白

肿瘤局部热疗诱导并过表达多种热休克蛋白（heat shock protein,HSPs），随后激活免疫系统来调节肿瘤微环境的免疫状态。热疗时肿瘤被加热至39℃～43℃，高温可通过增强周围TME的氧合和增加肿瘤的血流量，改变肿瘤细胞的病理生理环境。HSPs在树突状细胞的抗原识别中发挥积极作用，将HSPs结合的抗原多肽转运到主要组织相容性复合物-1（major histocompatibility complex,MHC-I）分子，触发抗原特异性T细胞活化[9]。HSP60（伴侣蛋白）参与抗原依赖的T细胞激活，刺激干扰素-γ分泌和T细胞激活[10]。HSPs在细胞内携带多种多肽物质，可形成HSP-抗原复合物，能被细胞毒性T细胞所识别，并引起特异性免疫反应[11]。

2.3 促进细胞因子的分泌

热疗刺激促炎因子的分泌（如白细胞介素-1、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α等），可直接杀死肿瘤细胞或进一步活化抗原提呈细胞，并趋化至肿瘤部位[12]。研究表明，发热可以控制淋巴细胞的转运，在小鼠或癌症患者的核心体温升高到约39.5℃后，体温范围内的全身热疗法会导致循环T细胞短暂下降，白细胞介素-6作为一种热敏转运效应因子，控制淋巴细胞和内皮细胞的黏附。热疗通过白细胞介素-6传递信号直接作用于淋巴细胞，刺激MEK1-ERK1/ERK2信号通路，促进L-选择素粘附，以及肌动蛋白基础的细胞骨架、α-肌动蛋白和L-选择素胞浆尾部之间的分子间相互作用，从而增强L-选择素非依赖性淋巴细胞的黏附和运输[13]。

2.4 清除体内肿瘤免疫抑制因子

癌细胞、基质细胞和免疫细胞分泌的VEGF-D和VEGF-C促进TME淋巴管的发育，促进肿瘤在远端器官的转移性增殖[14]，热疗可抑制VEGF-C/D的分泌释放，并诱导单核细胞分化为M1型巨噬细胞，促进炎性反应因子的形成[15]，给NK细胞、细胞毒性T细胞提供合适的微环境。

3 热疗对TME中关键免疫细胞的影响

研究表明，适宜温度的热疗能增强机体抗肿瘤免疫功能，促进白细胞介素-2和肿瘤坏死因子产生，增加局部淋巴细胞的浸润[16]，激活NK细胞及T细胞。

3.1 热疗与NK细胞

据报道，免疫细胞暴露在高温下对各种免疫细胞功能既有刺激作用，也有抑制作用[17]。在40℃以上的温度下（高于通常在发热或运动时达到的生理体温），NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性同时具有活性增强和抑制的作用[18]。在发热范围内的热应激（39.5℃）增强了人NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性，这种作用要求NK细胞的NKG2D受体发挥功能，当NK和肿瘤细胞靶点都激活时，NK细胞的杀伤能力最强[19]。热诱导的NK细胞变化导致细胞毒性改变的性质尚不清楚。但根据Milani等的研究，它至少是独立于MHC-I类/肽复合物的[20]。在经IL-2增强的NK细胞细胞毒性过程中，NK细胞与靶细胞之间形成偶联物时，激活受体NKG2D聚集在靶细胞接触部位[21]。为此，Ostberg等研究了温和的热应力对NK细胞表面NKG2D定位的影响：NKG2D在NK细胞表面的表达没有变化，但NKG2D在NK细胞表面的聚集有明显的短暂增加，NKG2D受体与抗NKG2D抗体交联或IL-2激活NK细胞导致类似的聚集[22]。然而NK细胞的激活状态可能会影响其对热应激的敏感度，因为在39.5℃下，IL-2激活的NK细胞没有表现出热增强的细胞毒性[23]。激活受体NKG2D的聚集可能与NK细胞的激活状态有关，IL-2激活NK细胞后，NKG2D聚集增强，热疗温度却不能进一步升高。因此，高温不会影响IL-2活化的NK细胞[24]。另外，在40℃以上的温度下观察到，与未处理的NK细胞相比，多聚胞苷酸激活的NK细胞具有更高的耐热性[25]。因此，根据NK细胞的状态和不同的激活途径，它们可能对热应激有不同的敏感度。

3.2 热疗与T细胞亚群

热疗可诱导免疫原性细胞死亡，导致新抗原的释放。因此，热疗可以提高CD8+T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。此外，热疗可以通过促进趋化因子的释放，将效应T细胞吸引到TME，通过突破血管屏障，也促进了T细胞的浸润[26]。另外，全身热水浴减少了外周血B和T细胞的总数，而CD8+T细胞显著增加。这表明热疗可以提高身体细胞免疫功能[27]。有体内研究显示，动物暴露于中等温度热疗极大地增加了L-选择素和α4β7整合素依赖性淋巴细胞向次级淋巴组织的转运[28]，导致全身热疗后数小时淋巴结内T细胞数量增加，这表明合适温度的热疗可刺激T细胞增殖和募集。另外，T细胞对热疗的反应也取决于不同的微环境，其调节机制极为复杂，体内发热温度可能会通过Th2诱导CD4+T细胞应答，但这一结果可能会被微环境中IL-12的存在和浓度进一步调节[29]。同时，在接受全身热疗的患者中，表达α4β7整合素的T细胞减少比外周表达CD5的T细胞数量减少的程度要小得多，而且只持续了很短的一段时间[30]，这也表明热疗可抑制T细胞与整合素细胞黏附分子-1相结合，有利于T淋巴细胞在TME的募集，而对成熟的T细胞的功能性影响不大。

4 热疗与免疫治疗联合的探索

通常情况下，热消融手术等局部热疗是针对单发或少发转移性疾病的患者进行的。但目前免疫检查点的发现以及免疫检查点抑制剂的开发为局部进展的肿瘤患者提供了新的视角，越来越多研究表明局部肿瘤治疗可以产生全身性的免疫治疗疗效。根据TME的免疫状态，肿瘤可分为“冷”型和“热”型，即免疫沙漠表型和免疫炎症型肿瘤。免疫炎症型肿瘤，也称为“热肿瘤”，其特点是高T细胞浸润、增加的干扰素-γ信号转导、程序性死亡受体配体 1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表达和高肿瘤突变负荷[31]。在免疫沙漠型肿瘤中，肿瘤及其周围CD8+T淋巴细胞浸润少，“冷肿瘤”还具有低突变负荷、低MHC-I类表达和低PD-L1表达的特征，而富集免疫抑制细胞群（包括肿瘤相关巨噬细胞、T调节细胞和髓源性抑制细胞）。其中“冷”型肿瘤对程序性死亡受体-1（programmed death-1,PD-1）/PD-L1抑制剂的应答率往往较低，原因是T细胞浸润少，PD-L1表达少，在驱使T细胞进入肿瘤的过程中，有许多因素可以影响T细胞启动和T细胞归巢至肿瘤附近，导致抗肿瘤免疫失败[32]。冷肿瘤由于免疫原性低而对免疫检查点抑制剂不敏感。热疗通过提供热休克蛋白的危险信号以及随后的免疫系统激活来调节TME的免疫状态。这种免疫调节作用不仅使热疗成为一种能够干预癌症的治疗方法，而且使热疗成为一种可靠的治疗方法，它可以创造一个Ⅰ型肿瘤微环境[33]，即PD-L1的过度表达和肿瘤浸润淋巴细胞的富集的肿瘤微环境，作为对免疫检查点抑制剂增强的补充。另外血清细胞因子分析显示，在41℃高热30分钟可诱导瘤内炎性细胞因子和趋化因子增加，增强T细胞的转运，有利于淋巴细胞浸润到肿瘤微环境并攻击免疫级联反应中的实体瘤[34]。热疗可能在局部进展或广泛转移的肿瘤患者中提高免疫治疗疗效以及改善预后。

有研究发现不同热疗方式联合其他疗法可以增强抗肿瘤免疫效果。目前已有使用酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼联合射频消融治疗肝细胞癌的研究。射频消融导致肿瘤特异性抗原原位释放且引起T淋巴细胞中PD-1表达上调，这与CD8+T淋巴细胞的耗竭有关。舒尼替尼通过抑制肝细胞生长因子抑制肿瘤T淋巴细胞中PD-1表达的上调。舒尼替尼对VEGF的抑制也促进了树突状细胞活化并抑制了肿瘤血管生成。联合治疗最终导致CD8+T淋巴细胞和树突状细胞显着增加以及T调节细胞减少，从而克服了单一疗法的缺点，舒尼替尼联合射频消融通过触发抗肿瘤免疫反应来治疗肝细胞癌[35]。Duffy等的一项研究也显示[36]，在射频消融和CTLA-4阻断剂联合应用治疗晚期肝细胞癌的患者中发现，将伊匹木单抗与热疗相结合的治疗方案是可行的，且在消融或栓塞区域之外产生了客观的肿瘤反应，表现为肿瘤内CD8+T细胞的积累和T细胞的克隆性降低。在另一项射频消融联合PD-1抑制剂治疗复发性肝癌时也显示出了良好的安全性[37]，结果显示PD-1抑制剂与射频消融联合治疗可改善复发性肝细胞癌患者的1年PFS和OS。

另外，纳米粒子介导的光热疗法（photothermal therapy,PTT）已开发为一种新的癌症治疗策略，它利用肿瘤中积累的光吸收剂吸收的光能产生的热量来消融肿瘤。Chen等的研究发现，在免疫佐剂纳米粒子存在下，PTT治疗后肿瘤消融在原位产生的肿瘤相关抗原可以显示出类似疫苗的功能，结合检查点阻断显示出强大的抗肿瘤作用[38]。还有研究者更是开发了一种光热辅助免疫治疗（symbiotic mild photothermal-assisted immunotherapy,SMPAI）策略，将近红外（NIR）光热剂IR820和程序性死亡配体1抗体（anti-PD-L1）加载到具有凝胶—溶胶（热可逆）相变特性的脂质凝胶库中：通过控制凝胶强度实现让纳米材料在不同肿瘤中停留时间一致；可以通过调整载药量来控制暴露剂量，以保持最低有效剂量的焦点浓度；可通过控制凝胶-溶胶相变来调节药物释放量和释放时间，实现持续的抗肿瘤作用。并在小鼠模型中验证了SMPAI策略可放大T细胞免疫反应并使TIL水平相对较低的“冷”肿瘤的对免疫治疗敏感，同时诱导幼稚T细胞分化为CD8+T细胞，有助于抑制远处肿瘤的生长并防止肿瘤转移[39]。

磁热疗（MHT）因具有良好的疗效、无创性、对正常组织的损伤最小、成本低、组织渗透性好，受到越来越多的关注。在过去的20年中，已经成功地对胶质母细胞瘤和前列腺癌患者进行了向瘤内富集磁性纳米颗粒的第一阶段和第二阶段临床研究[40-41]。对前列腺癌患者的Ⅰ期临床研究证明了磁热疗的可行性，但在肿瘤中实现和维持热疗的场强和频率并非易事，磁热疗后虽然PSA下降，但单一疗法的疗效范围和持续时间有限。由于热疗的疗效在很大程度上受到所达到的温度和保持时间的影响，未来的研究必须通过密切检测肿瘤温度来确保热疗有效。

目前的研究中，精确控制温和的PTT温度不仅对调节药物释放很重要，而且对免疫缺陷肿瘤的致敏性以及增强抗PD-L1治疗的作用也至关重要。因此，在未来的研究中，必须在体内建立更完整的温度-效应关系以优化治疗效果。

5 总结和展望

本文简述了热疗引起肿瘤患者免疫系统改变的主要途径，并对抗肿瘤免疫的主要组成部分NK细胞和T细胞群的研究进展及免疫治疗跟热疗联合的基础理论和部分临床应用做了简要的总结。

目前，热疗已广泛应用于临床实践，在多种恶性肿瘤的临床试验中取得了良好的疗效。许多研究者倾向于探索热疗与其他疗法的联合治疗。未来热疗与其他疗法相结合时，应当关注最佳温度、持续时间、顺序和时间间隔等更精确的知识；利用通过增加更多抗癌治疗提供的交叉协同作用，以获得新的多模态治疗组合；开发能够更精确温度控制的新加热策略，使热疗得到最佳利用。热疗联合免疫治疗是一种值得关注的新治疗模式，未来需要更多的探索。