孙瑞欣 ，赵帅帅 ，申宇哲，梁家兴 ，杨彦玲△

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）通常会导致永久性的功能损害，其主要表现为炎症加重、胶质瘢痕和神经元死亡。脊髓的原发性机械损伤会引发炎性细胞浸润和小胶质细胞激活等继发性损伤［1］。研究显示，世界各地的SCI 发病率为百万分之三到万分之二［2］，粗略估计我国每年大约有1万人发生SCI［3］。目前，SCI 尚缺乏有效的治疗方法。研究表明，抑制SCI 后大鼠神经细胞凋亡以及促进自噬减少自噬小体的积累均可减少SCI后神经元损伤并促进运动功能的恢复［4］。SCI 后产生的炎症相关细胞因子Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）和白细胞介素（interleukin，IL）-6是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信号通路的重要上游调节因子。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是细胞响应胰岛素、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等细胞外刺激的主要细胞信号枢纽，参与细胞的营养吸收、合成代谢等多种过程，在细胞的存活、增殖、生长、代谢、转移和血管生成等方面起着至关重要的作用［5］。目前，靶向调节PI3K/AKT/mTOR 信号通路对研究和治疗SCI有较好的前景。本文综述了PI3K/AKT/mTOR 信号通路在神经元自噬过程中的作用机制及其对SCI 的调控作用，以期为相关研究提供新思路。

1 自噬

1.1 自噬概述 生物体需要通过不断合成和降解物质来维持自身内环境的稳态，其中自噬发挥了重要的作用，它是一种细胞利用溶酶体将自身物质降解，使之得以循环利用的现象。根据被降解的细胞内容物运输到溶酶体方式的不同，自噬分为巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）［6］。巨自噬是主要的自噬形式，主要包括以下4个步骤：隔离膜或吞噬泡形成，吞入一部分细胞质形成自噬体（双层膜细胞器），外层自噬体膜和溶酶体融合，在自噬溶酶体内溶酶体酶降解自噬体内膜和细胞器［6-8］。巨自噬流（autophagic flux）是以上4个步骤在细胞内不断变化的一个动态过程，其中任何一个环节有偏差均会影响细胞的状态，它不仅参与细胞代谢，还与蛋白代谢和蛋白毒性密切相关，适当的自噬会保护细胞，防止代谢应激和氧化损伤，但自噬过度可能导致代谢应激、细胞成分降解，甚至细胞死亡［9］。微自噬是由溶酶体膜内陷，直接吞噬细胞质内容物后进行分裂降解的现象。CMA是一种选择性的自噬，它需要分子伴侣的协助才能完成跨溶酶体膜的转运。

1.2 神经元自噬标志物 自噬相关蛋白（autophagy-related protein，Atg）参与调节自噬的诱导、起始、延伸以及自噬体的降解等过程。哺乳动物Beclin1基因与酵母Atg6基因同源，在3-磷酸磷脂酰肌醇单磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P）的生成过程中起重要作用，而PI3P 可以募集其他Atg 并结合到早期隔离膜或吞噬泡上，表明Beclin1在自噬和溶酶体的转运中起重要作用［10］。PI3P 的作用是与Ⅲ类PI3K结合，参与自噬早期的前双层膜形成，从而启动自噬［11］。目前，研究最广泛的自噬分子标志物为Atg8/微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated protein1 light chain 3，LC3），在自噬进展的过程中起重要作用，当自噬被诱导时，胞质可溶的LC3-Ⅰ与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）结合后，在自噬体膜上转化为LC3-Ⅱ；在自噬溶酶体的形成过程中，LC3-Ⅱ逐渐被降解清除，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与自噬体的数量呈正相关，常被视为自噬形成的标志，也可以用来监测自噬的进程［9,12］。选择性自噬体膜受体蛋白（sequestosome-1，SQSTM1）也叫p62 蛋白，它在所有组织中均有表达并且广泛分布于细胞质、细胞核、线粒体、自噬体和溶酶体中，可识别泛素化的错误折叠蛋白和受损的细胞器，当这些泛素化的错误折叠蛋白和受损的细胞器被p62 识别后，通过LC3-Ⅱ的招募，和p62 一起被转运至自噬溶酶体并降解［4，13］。因此，可以通过p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ来判断自噬溶酶体的活性和自噬通量的强度［12，14］。

2 PI3K/AKT/mTOR信号通路

近年来研究发现，通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路可以激活神经元自噬，促进SCI后神经元的修复［15］。PI3K分子可被生长因子激活而磷酸化。目前，根据结构、功能和底物偏好不同，PI3K可分为3类：Ⅰ类 PI3K 接受酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinase，RTK）和G 蛋白偶联受体（guanosine-binding protein coupled receptor，GPCR）的信号后，可催化磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol bisphosphate，PIP2）生成磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3），然后PIP3 进一步激活AKT（又称蛋白激酶 B；protein kinase B，PKB）［16-17］，PI3K/AKT通路特指Ⅰ类PI3K；Ⅱ类PI3K可能影响葡萄糖转运、细胞迁移、膜转运调节、胰岛素信号传导和受体 内 化 ，还 可 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol，PI），但不磷酸化 PIP2；Ⅲ类PI3K目前己知的只有一种，被认为可以控制溶酶体成熟、自噬流和胞质分裂等多种膜转运功能，激活Ⅲ类PI3K可以促进自噬，能使PI磷酸化为PI3P［5，16，18］。

磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue，PTEN）是 PI3K 的拮抗剂，可以将PIP3脱磷酸化变为PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的启动［19］。AKT 是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其PH结构域为存在于多种信号转导蛋白和细胞骨架蛋白中的大约由120个氨基酸组成的功能性区域，可以与Ⅰ类PI3K 产生的PIP2 和PIP3 相互作用，使AKT 从胞质转移到胞膜并被激活，启动PI3K/AKT/mTOR 通路，进而激活mTOR，抑制自噬［18,20］。PI3K/AKT/mTOR途径是mTOR活化和发挥功能的主要途径之一［21-22］。mTOR 通过与 mTOR 复合物（mTOR Complex，mTORC）1 和 mTORC2 的关键组分如雷帕霉素靶向蛋白调节相关蛋白（regulatoryassociated protein of mammalian target of rapamycin，Raptor）、雷帕霉素不敏感伴随物（rapamycininsensitive companion of mTOR，Rictor）、哺乳动物致死性 SEC13 蛋白 8（mammalian lethal SEC13 protein 8，mLST8）和哺乳动物应激激活的蛋白激酶反应蛋白 1（mammalian stress-activated protein kinase interacting protein，mSIN1）作用，催化 S6 激酶（S6 kinase beta-1，S6K1）、真核细胞起始因子4E（eIF4E）结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）和自噬启动蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）等多个靶标的磷酸化，从而调节蛋白合成、营养代谢、生长因子信号传导、细胞生长和迁移以及自噬调节等，其中ULK1 还可以和其互作蛋白Atg13 和Atg101 等形成自噬调节复合物［23-24］。mTORC1 可调节蛋白质合成和细胞的生长、增殖、代谢以及应激反应，mTORC1 中富含AKT的底物，当PI3K/AKT被激活时，mTORC1活化，通过磷酸化下游效应因子S6K1 和4E-BP1 来促进蛋白质、脂质和核苷酸的合成代谢过程，同时，通过ULK1抑制分解代谢程序，使自噬调节复合物失活，从而抑制自噬；mTORC2 可以调节细胞凋亡和肌动蛋白细胞骨架的重新排列，它通过mSIN1 和AKT 形成一个正反馈环路，即AKT 的部分激活促进mTORC2 的激活，而mTORC2 磷酸化并完全激活AKT，被激活的AKT 可以通过磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1）将AKT 的第308 位的苏氨酸磷酸化，促进细胞存活［23，25-26］。

3 PI3K/AKT/mTOR 信号通路与自噬在SCI 修复中的作用

PI3K/AKT/mTOR 信号通路是一个经典的自噬激活途径。研究显示，褪黑素（melatonin，MT）通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路，在急性SCI 后第7天降低了凋亡激活蛋白（活性Caspase-3 和活性Caspase-9）的表达和凋亡神经元的数量，而增加了自噬激活蛋白（LC3 和Beclin-1）的表达和神经元的数量，在大鼠SCI 后第7 天开始改善运动功能障碍［27］。然而，过度的自噬可能会导致神经元死亡。研究发现，当自噬过度时，可通过激活PI3K/AKT/mTOR 通路来抑制过度自噬，从而促进神经元的存活［28］。

3.1 对自噬流的调节 由于继发性损伤是SCI后加重的主要因素，自噬在继发性损伤过程中的作用也各不相同，但越来越多的证据表明自噬在SCI 中的作用大多是有益的［29］。由于自噬功能的实现取决于自噬流，在大多数SCI 中的自噬流受到抑制的情况下，自噬有可能导致神经元死亡并加剧炎症反应、氧化应激和微循环障碍［30］。Li 等［31］研究发现，SCI 模型大鼠在经过姜黄素治疗后，胶质瘢痕形成和炎症反应减轻，脊髓髓鞘形成改善，并且姜黄素可以促进SCI 后自噬流的诱导，抑制AKT/mTOR 信号通路的激活，这表明姜黄素可以通过抑制AKT/mTOR 途径来诱导自噬，促进自噬流量恢复，从而促进SCI后的运动功能恢复，减少神经元凋亡。有研究对SCI 模型兔行减压手术后发现，兔的运动功能有恢复趋势，并且逆转了SCI 引起的p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白的上调，AKT/mTOR通过调节自噬流，促进了自噬体膜上LC3 Ⅱ的生成，并在自噬溶酶体形成后促进了LC3-Ⅱ和p62 降解，从而恢复了自噬流以减轻神经元凋亡，促进了SCI后的恢复［32］。

3.2 调节内质网应激 目前，对内质网的研究也是一大重点，SCI后导致的持续的内质网应激超过未折叠蛋白反应的补偿，往往会对神经元产生不利影响。内质网应激和自噬之间存在着一定的关系。Wang等［33］用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）诱导PC12 细胞建立SCI 模型，发现4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）可 以 通 过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制内质网应激，从而负向调控自噬；当内质网应激抑制该通路时，NGF 诱导的PC12细胞机械损伤早期会增加细胞自噬和减少细胞凋亡，证实了通过该通路抑制内质网应激可增加自噬，这为SCI的治疗提供了新的思路。

3.3 抑制神经元凋亡 神经元凋亡可导致瘢痕形成、组织损伤和运动功能障碍等。Li等［27］研究显示，MT可增加自噬激活蛋白的表达，降低SCI后神经元凋亡激活蛋白的表达水平，改善SCI后第7天大鼠的运动功能，MT 可通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路增强神经元自噬，抑制细胞凋亡来改善运动功能障碍。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）锌指蛋白反义链 1（ZNFX1-antisence 1，ZFAS1）是一种竞争性内源性RNA，可与共享的非编码小分子RNA（microRNAs，miRNAs）结合，从而调节信使 RNA（mRNAs）的表达。Chen 等［34］发现，在SCI 小鼠的脊髓组织中ZFAS1表达上调，而miR-1953 表达下调；PTEN 是 miR-1953 的一个潜在靶点，miR-1953 可以通过靶向 PTEN 的 3'UTR 负调控PTEN的表达；与SCI小鼠相比，敲除ZFAS1的SCI小鼠miR-1953 表达水平升高，运动功能改善，促炎因子水平降低，脊髓神经元的凋亡减少；与仅敲除ZFAS1的 SCI 小鼠相比，同时抑制 miR-1953 或同时过表达PTEN后，消除了敲除ZFAS1对SCI小鼠脊髓神经元凋亡和炎症的抑制作用；该研究认为ZFAS1可通过与miR-1953 结合，调节PTEN/PI3K/AKT 通路，抑制脊髓神经元的凋亡，并促进SCI的恢复。另有研究发现，机械损伤后脊髓神经元中的AKT 快速增加，mTOR 的磷酸化水平快速上调，从而抑制了PI3K/AKT/mTOR 信号转导通路，增加了自噬水平，使线粒体膜电位降低，细胞凋亡减少，表明PI3K/AKT/mTOR 信号通路还可以通过调控自噬来调节SCI后的线粒体凋亡，从而促进神经恢复［15］。

3.4 抗炎症反应 自噬过程中的LC3、Beclin-1 蛋白以及凋亡反应中的Caspases家族、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和B淋巴细胞瘤-2 家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与炎症反应［35］。Zhang 等［36］对SCI 后SD 大鼠尾静脉注射外周巨噬细胞衍生的外泌体（peripheral macrophages-derived exosomes，PM-Exos）发现，PM-Exos 组脊髓功能和恢复情况优于注射相同剂量磷酸盐缓冲溶液的对照组，并且其机制的关键因素是通过下调PI3K/AKT/mTOR 信号通路来激活和促进小胶质细胞自噬，从而增加抗炎型小胶质细胞极化，刺激局部小胶质细胞的抗炎特性，发挥对SCI的保护作用。

3.5 促进髓鞘再形成 SCI后运动和生理功能障碍的一大原因是轴突脱髓鞘，导致轴突延长障碍并且备用回路减少，而少突胶质细胞最突出的生理功能是在神经元周围形成紧密的髓鞘。因此，少突胶质细胞的变性是SCI脱髓鞘和轴突功能障碍的主要因素 。 Ding 等［37］研 究 证 实 ，神 经 调 节 蛋 白 -1（neuregulin，Nrg1）可以通过激活反应性星形胶质细胞表面的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）从而增强细胞内信号级联转导的PI3K/AKT/mTOR 通路功能，促进髓鞘和少突胶质细胞相关基因的表达，从而将反应性星形胶质细胞转化为少突胶质细胞样细胞，促进SCI 的修复。Liu等［38］研究证实，雷帕霉素干预SCI小鼠后自噬增强，促使 SCI 后 Beclin-1、LC3 表达升高，p62 表达降低，并增加了脊髓白质的完整性，减少了胶质瘢痕的形成和脊髓组织的损失，增加了SCI 后小鼠轴突和雪旺细胞相关髓鞘的数量，使小鼠运动功能得到改善，并降低了小鼠体质量，雷帕霉素可以通过抑制mTOR和增强自噬来减轻SCI后的炎症反应，促进少突胶质细胞的恢复和髓鞘的形成，限制轴突变性。

3.6 促进轴突再生 Chen 等［39］研究发现，SCI 急性期至亚急性期星形胶质细胞PI3K/AKT/mTOR 通路被激活并可能参与了胶质瘢痕的形成；SCI 后PTEN的过表达下调了硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）的表达水平，改善了损伤部位的轴突再生，腺病毒载体过表达PTEN 可减轻胶质细胞增生，减少脊髓中神经胶质瘢痕的形成，改善 SCI 后的运动功能。Yin 等［40］证实，miR-29a 可降低PTEN表达，促进AKT磷酸化，提高轴突的生长能力，过表达miR-29a 则可增加AKT 和通路下游次级结合蛋白S6 磷酸化，促进轴突再生相关关键标记蛋白neurofiament-200 的表达，从而促进损伤中心的轴突再生和突触形成，并最终促进运动功能的恢复。

4 小结

目前，自噬在SCI 后继发性损伤的作用机制仍缺乏广泛的研究。自噬在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中均发挥了重要作用。SCI 后PI3K/AKT/mTOR 信号通路被过度激活，导致自噬受到抑制，加重了错误折叠蛋白和炎性因子等的蓄积，而且神经元损伤后的自我修复能力非常微弱。PI3K/AKT/mTOR 作为自噬的经典信号通路之一，可以调节神经元生长和分化的信号并启动自噬相关基因，抑制该通路可以增加Beclin1蛋白等的表达，从而激活神经元自噬，调节神经元分化与增殖、减轻炎症和抑制神经元凋亡，促进脊髓损伤后神经元修复，从而能在一定程度上减轻病情。