舒小燚，李有霞，范绍辉，王红嫚

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指继发于内皮-上皮屏障的破坏、肺泡损伤和肺水肿，以呼吸窘迫、顽固性低氧血症和呼吸衰竭为特征的急性炎症性肺损伤［1］。目前该病治疗的重点是保护性肺通气策略，尚无特效药物，总病死率高达45%［2］，给社会带来了沉重的医疗和经济负担。特别是随着2019 年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情在世界范围的暴发，大量感染者的结局是病毒性肺炎引起的ARDS，最终导致死亡。因此，探明ARDS相关病理机制，发现更有效的治疗靶点，对于ARDS 的防治和降低病死率具有重要意义。目前研究发现，炎症反应的失控在ARDS 的病理进程中扮演关键角色，而高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）和Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）是促发炎症反应的关键介质，介导ARDS 炎症发展的病理进程。本文就HMGB1、TLR4和两者之间的关联在ARDS中的作用和相关治疗进展进行综述。

1 ARDS概述

ARDS 的发病原因较多，其中临床常见的主要为肺炎、非肺源性脓毒症、异物吸入和重大创伤。炎症反应的失控、肺泡毛细血管屏障功能障碍、凝血与纤溶异常、氧化应激失衡等均参与ARDS 的病理进程。其中，“炎症反应的失控”被认为是ARDS 发病机制的本质。ARDS 发生时，过量的巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞以及内皮细胞等炎性细胞在肺内聚集，产生白细胞介素（interleukin，IL）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等多种促炎因子，使血管内皮通透性增加，各种炎性细胞、富含蛋白的水肿液及红细胞进入肺泡腔和间质内，进一步加重肺损伤，导致急性炎症反应失控的“瀑布样”级联效应［3］。近年来，随着对该病研究的深入，体外膜肺氧合、肺通气策略、俯卧位、神经肌肉阻滞剂和糖皮质激素等已成为降低ARDS患者病死率的治疗措施和相关药物［1］，但是仍缺乏有效且统一的治疗性干预手段来减轻ARDS持续的肺部炎症损伤和降低病死率。减轻炎症反应的强度可能是ARDS治疗的关键环节。

2 HMGB1在ARDS中的作用

HMGB1 因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移率而得名，由216 个氨基酸残基构成，形成2 个N端结构域和1 个 C 端酸性结构域（186-215aa），N 端分别由HMG A 盒（9-79aa）和HMG B 盒（95-163aa）组成。据报道，HMGB1的促炎活性区域主要定位于B 盒，而A 盒具有抗炎的作用，可作为HMGB1 拮抗剂［4-5］。研究进一步证实HMGB1可以与多种蛋白结合并相互作用，氨基酸残基150-183 与晚期糖基化终产物的受体（advanced glycation end product receptor，RAGE）结合后可促进细胞迁移，而残基89-108 和残基 7-74 则分别与 TLR4 和 p53 反式激活结构域结合，促进炎症反应和基因转录［4］。HMGB1作为内源性损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的一份子，是炎症中引发先天性和适应性免疫应答的关键介质，主要存在于细胞核中［6］。当细胞受到“危险信号”刺激时，HMGB1可以被迅速激活并释放到细胞外，直接充当炎性细胞因子，启动和维持由传染性或非传染性疾病引起的免疫反应，并在受损组织中维持免疫平衡［7］。HMGB1 分布于哺乳动物的多种器官和组织中，在肺组织的分布尤其广泛。肺组织损伤或氧化应激时，单核/巨噬细胞和自然杀伤细胞等炎性细胞可主动分泌HMGB1；细菌产物、内毒素等外源性刺激和TNF-α、干扰素等内源性刺激均可以诱导HMGB1 的被动释放。研究表明，细胞外HMGB1 作为一种晚期促炎因子，通过与相应受体如RAGE、TLRs、N-甲基-D-天门冬氨酸受体 1（NMDAR1）、CXC 趋化因子受体4、T 细胞免疫球蛋白黏蛋白3 和α-突触核蛋白等结合，激活巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、T 细胞、内皮细胞以及上皮细胞等多种炎性细胞，进而启动丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）、Janus 激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、活性氧（ROS）等促炎相关信号通路，诱导多种细胞因子生成，形成炎症级联反应［4］。目前仅有 RAGE 和 TLR4 被确定为功能性HMGB1受体［4-5，8］。

HMGB1 在ARDS 的病理过程中扮演着重要角色。动物体内实验发现，在小鼠气管内滴注重组HMGB1（rHMGB1）会引起肺组织嗜中性粒细胞募集，并伴有肺组织损伤和肺泡内炎症反应以及肺通透性的增加，最终造成急性肺损伤（ALI）/ARDS［9］。在ALI 的发展过程中，黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎症小体被激活，调节半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 的活化，然后促进细胞因子前体pro-IL-18 和pro-IL-1β的成熟和释放，诱导肺部炎症；而HMGB1可以激活巨噬细胞中的AIM2 炎症小体，通过TLR2、TLR4和RAGE/NF-κB 信号通路诱导M1 巨噬细胞的极化来参与ALI的发病［10］。另有研究发现，HMGB1激活PI3K/AKT/mTOR 通路后，树突状细胞可通过该通路调节ALI中的急性肺部炎症和病理损伤［11］。另有研究表明，HMGB1 可在脂多糖、TNF-α 和IL-1β 刺激下从巨噬细胞中主动释放，随后通过激活NF-κB易位，增加促炎细胞因子水平和增强肺通透性来促进内毒素诱导的ALI/ARDS，而阻断HMGB1 或敲除磷酸酶-张力蛋白同源物（PTEN）基因可通过破坏巨噬细胞HMGB1/PTEN 减轻小鼠肺损伤［12］。连接蛋白（Connexin，Cx）通道有助于嗜中性粒细胞和巨噬细胞在ALI 期间的移动和募集，经Cx 阻断剂P5 干预后，通过抑制HMGB1 的细胞外释放，可减少经脂多糖诱导的ALI 小鼠肺泡灌洗液中的白细胞，表明在ALI中该通道的通透性与炎性细胞的迁移率呈正相关［13］。肺泡上皮细胞（AECs）通过合成和分泌表面活性剂促进正常呼吸。在ALI/ARDS 期间，AECs 可分泌大量炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6）和趋化因子［ 如 单 核 细 胞 趋 化 蛋 白 -1（monocyte ehemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-8］来参与炎症反应。Zhou 等［14］利用脂多糖刺激 A549 细胞后发现，HMGB1/RAGE 通路被激活，而抑制长链非编码RNA 核富集转录体1（LncRNA NEAT1）的表达可阻断 HMGB1/RAGE 信号通路，表明 NEAT1 在 AECs 参与的炎症反应中可能具有促炎作用；进一步研究发现，ALI小鼠肺组织中NEAT1高表达，而抑制其表达后肺部炎症减轻，死亡减少。肺微血管内皮细胞在维持微血管腔和肺间质之间的内皮屏障完整性方面起着关键作用。内皮细胞的屏障功能取决于细胞完整性、细胞连接复合物中蛋白质的协调表达和相互作用，包括F-肌动蛋白细胞骨架、黏附连接（AJ）和紧密连接（TJ）。内皮细胞的细胞骨架重排、AJ 与TJ 的破坏可引起屏障通透性增高，导致细胞收缩和细胞间隙形成。而HMGB1 可以破坏细胞间连接，增加细胞屏障通透性，最终导致血管外高蛋白性水肿［15］。

目前众多的临床研究结果也与动物体内实验研究结果一致。郭小芙等［16］发现，合并ARDS 患者的血清HMGB1 表达水平明显高于普通脓毒症患者和健康志愿者，HMGB1表达水平的升高可能是脓毒症患者并发ARDS 的危险因素之一，HMGB1 介导的炎症反应参与了脓毒症患者肺组织损伤过程。孙丽等［17］研究显示，ARDS死亡患者血清IL-6及HMGB1表达水平均显著高于存活组，而IL-10 水平低于存活组，IL-6、IL-10及HMGB1可作为ARDS 患者预后结局的预估指标。Chen 等［18］发现，COVID-19 引起的ARDS患者血清HMGB1水平明显升高，甘草甜素作为HMGB1 的直接抑制剂可以明显改善其预后。综合以上结果可以推测HMGB1 是介导ALI/ARDS病理过程中炎症反应的重要靶点。

3 TLR4的概述及在ARDS中的作用

TLRs 作为模式识别受体（pattern recognition receptor，PPR）家族中的一员，可通过识别外源性病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）和DAMP，并通过一系列信号转导机制诱导炎性因子如IL-1、IL-6、TNF-α和细胞间黏附分子-1等表达，介导机体免疫应答与组织损伤。目前已经证实，TLRs 可在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞中表达，而非免疫细胞如血管内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞也可见TLRs 表达［19-20］。TLR4 既可以通过 PAMPs 识别细菌、病毒、真菌和寄生虫，也可以通过DAMPs 激活HMGB1、热休克蛋白、细胞外基质降解产物等内源性化合物，通过细胞内信号转导途径激活先天免疫防御，导致促炎因子和趋化因子在组织损伤期间释放，同时激活TLR4非感染性途径，诱导组织修复［8］。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性和非依赖性途径是TLR4诱导炎症因子和刺激因子释放的主要信号转导通路。MyD88依赖性信号转导途径指MyD88 氨基端与IL-1 受体相关激酶结合，使后者发生自身磷酸化，促使TNF受体相关因子-6 的激活，活化NF-κB 和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）转录因子，使其转位到细胞核，最终促使IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子的释放。MyD88非依赖性信号转导途径指TIR结构域衔接蛋白作为适配子蛋白与TLR4结合，使TNF受体相关蛋白因子3 和受体相互作用蛋白1 磷酸化，导致NF-κB 活化因子结合激酶 1 和 MAPK 激活，分别募集干扰素调节因子3及其家族成员，使激活蛋白1被活化，从而导致促炎因子的产生［21-22］。

Huang等［23］发现，TLR4通过激活MyD88/NF-κB途径可以加重机械通气诱发的肺损伤，而使用抗TLR4单克隆抗体预处理的大鼠可通过抑制MyD88/NF-κB 信号通路来保护其免受此类肺部损伤。在LPS诱导的ALI/ARDS小鼠模型中，小鼠肺部病理损伤和炎症改变可能与TLR4/MYD88/NF-κB 信号通路有关，通过敲除小鼠TLR4基因可以减轻LPS诱导的ALI 小鼠肺内的炎症和凋亡程度，进一步证实TLR4在ALI/ARDS中具有靶向作用［24］。另有研究发现，在ARDS大鼠模型中用抗TLR4单克隆抗体进行预处理后，大鼠肺损伤、炎症浸润和肺水肿减轻，TNF-α 和IL-1β 表达降低，TLR4、MyD88 和NF-κB表达水平下降，而且动脉血氧分压升高，这些结果表明，通过抑制TLR4/MyD88 信号传导途径可调节巨噬细胞激活和炎症反应［25］。体外实验也发现，在LPS 诱导人肺上皮细胞出现类似ARDS 的损伤后，TLR4、NF-κB 以及相关炎性因子的表达明显增加［26］。在进一步体外实验中，通过抑制TLR4/MYD88/NF-κB 通路显著减少了肺内皮细胞的凋亡［24］。在临床研究中也发现，TLR4 在 ALI/ARDS 中具有重要作用。陈显峰等［27］分别采集脓毒症合并ARDS 无镇静处理患者和右美托咪定处理患者的中心静脉血和肺泡灌洗液进行相关检测，发现经右美托咪定镇静处理后患者血清IL-6、TNF-α 表达及肺泡灌洗液中TLR4和MyD88蛋白表达均较镇静前明显下降，该研究指出，右美托咪定镇静可能依赖于TLR4/MyD88 信号途径减轻脓毒症合并ARDS 患者的炎症反应。

结合多方面的研究可以推断，通过TLR4调控炎症反应可能在ARDS的病理损伤过程中具有重要作用，研发更多针对TLR4靶点的治疗药物可以为临床降低ARDS患者的病死率提供新的思路。

4 HMGB1/TLR4信号通路与ARDS

目前已知HMGB1 的受体有10 余种，但是被广泛研究且作用明确的主要是TLR4 和RAGE。HMGB1可以引发包括炎症在内的多种细胞反应，通过与TLR4 结合介导炎症过程的激活［28］。随着各类研究的不断深入，HMGB1/TLR4 信号通路介导炎症反应的作用机制更加明确，通过调控HMGB1/TLR4信号轴可以缓解病毒性肝炎时的肝损伤［29］；抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路可以降低骨关节炎患者血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，从而减轻关节炎症反应［30］。最新研究证实，HMGB1/TLR4 信号通路调控的炎症反应在肺部损伤中同样具有重要作用，通过收集放射性肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液进行检测，发现HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平均有上升；而且通过培养小鼠白化病上皮细胞和小鼠单核细胞发现，细胞中TLR4 的表达增加，但是当使用不含HMGB1 的条件培养基时，TLR4 的表达却未见明显变化［31］。另有研究表明，在小鼠哮喘模型中，通过竞争性抑制HMGB1与TLR4的结合，可以减少下游NF-κB 的释放，减轻炎症反应，从而改善小鼠的哮喘症状［32］。为了确认HMGB1/TLR4信号通路和ALI/ARDS之间的相关性，有研究向小鼠气管内滴注不同剂量rHMGB1，结果发现，rHMGB1以剂量依赖方式诱导ALI/ARDS 发生，通过肺部病理切片可以观察到明显的ARDS 损伤，包括肺泡间隔增厚、间质水肿、血管充血和间质中性粒细胞浸润，检测相关指标发现TLR4 蛋白、TLR4 mRNA 和促炎细胞因子的表达水平明显升高，且肺损伤以及促炎细胞因子水平在抑制TLR4 后有所下降［33］。Tadie 等［34］发现，在小鼠 ALI/ARDS 模型中，TLR4 通过DAMPs 识别HMGB1，诱导中性粒细胞外诱捕网的过度形成，促进TNF-α 和IL-1β 等促炎因子的产生，以及血管内皮损伤和渗漏，加重ARDS 小鼠肺部损伤及炎症反应。因此，可以推测HMGB1/TLR4信号通路调控的炎症反应在ALI/ARDS 的病理过程中扮演重要角色，通过寻找针对HMGB1、TLR4 和HMGB1/TLR4 信号通路的拮抗剂可以为临床治疗ALI/ARDS 的肺部损伤并改善其预后提供新的思路。

在抑制HMGB1依赖性炎症过程中，已经出现针对阻断HMGB1/TLR4 信号通路的拮抗剂。抗HMGB1抗体和重组HMGB1 A盒蛋白在多种炎症疾病模型中已显示出显著效果［35］。在HMGB1 诱导的人巨噬细胞的研究中，P5779 被认定为一种特异性MD-2 拮抗剂，可竞争性抑制 HMGB1 与 MD-2 的结合，从而抑制TLR4信号的传导，减少TNF的释放；而叶酸、甲氨蝶呤因与P5779具有相似的结构，低浓度的叶酸和甲氨蝶呤在HMGB1 诱导的人巨噬细胞研究中均有抑制TNF释放的作用。因此，叶酸、甲氨蝶呤也可能作为减轻该类炎症的药物［36-37］。抗HMGB1 m2G7 可以与HMGB1 A 盒中的一个表位结合（位于HMGB1 序列的氨基酸53-63），影响HMGB1 与 RAGE 和 TLR4 相互作用；在脂多糖诱导的大鼠败血症模型的研究中，应用抗HMGB1 m2G7治疗后小鼠生存率明显提高［38-39］。白藜芦醇可以通过激活SIRT1 以抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信号传导和随后的神经炎症反应［40］；在大鼠哮喘模型的研究中也证实其可下调肺组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的表达及降低气道壁厚度［41］。右美托咪定则是通过激活胆碱能抗炎途径下调 TLR4 的表达来减轻炎症反应［27，42］。此外，抗HMGB1 单抗10-22、血栓调节蛋白、触珠蛋白、二甲双胍等HMGB1 受体拮抗剂也被证实对多个炎症疾病模型有治疗作用［43-44］。但在ARDS 的临床诊疗中尚鲜见应用针对阻断HMGB1/TLR4信号通路拮抗剂疗效的相关报道，可见今后在该方向还具有广阔的探索空间。

5 总结与展望

HMGB1 可通过与 TLR4 结合在 ARDS 中发挥促炎作用，诱导下游炎症通路的激活，刺激大量促炎因子的释放，使各种促炎因子相互作用，进一步放大炎症反应，最终导致ALI/ARDS 肺部损伤的加重，但是HMGB1/TLR4 信号通路在ARDS 肺部损伤中作用的具体机制还需进一步阐明。除此之外，目前HMGB1/TLR4拮抗剂已在多种炎症疾病模型中取得了进展，但临床研究仍未见显著成效。因此，寻找更明确的HMGB1/TLR4 信号通路在ALI/ARDS 的发生和发展中作用的证据，以及开发新型、有效的HMGB1/TLR4 拮抗剂可能为今后ARDS 的治疗提供更多的选择。