王丁丁，杨又兵*，雷 莹，王丹晖，娄 然

1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003；2.洛阳市动物遗传育种重点实验室，河南 洛阳 471003

甘草是常用中药材的一种，被称为药中之国老[1]。甘草多糖是甘草活性成分中的一种，可以进行免疫调节，可以抗肿瘤和病毒，也没有细胞毒副作用[2]，是饲料添加剂的一种选择。在免疫调节功能方面，蔡珊珊等[3]证明了甘草多糖是一种安全的免疫增强剂和佐剂候选材料。在抑制肿瘤细胞的方面，Zhang 等[4]发现甘草多糖可以抑制肿瘤在体内的生长，并通过肠道菌群发挥其作用。在抑菌方面的研究中，付道斌等[5]发现了甘草多糖对促进鼠伤寒沙门菌体外生长不是无限的，使小鼠抵挡鼠伤寒沙门菌感染的能力得到了改善；董永军等[6]发现，甘草多糖作为饲料添加剂饲喂肉鸡使肉仔鸡体重得到了提升。

目前，国内外关于甘草多糖在鸡上的应用研究较少，饲料中适合的添加量不统一，通过转录组测序技术可以分析不同浓度甘草多糖饲喂的肉鸡差异表达基因，从中发掘肉质调控基因，基于转录组测序技术对肉鸡的基因表达差异进行分析研究有助于研究甘草多糖对肉鸡肉质相关候选基因表达的影响，为进一步阐述其对肉鸡肉质影响的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

1 日龄爱拔益加健康肉公鸡购自市场。日粮中分别添加0（对照组）、900 mg/kg（试验组）甘草多糖，2 组肉鸡饲喂42 d 各取3 只肉鸡胸肌组织标记后放于液氮中，用于后续RNA-seq 和RT-qPCR 试验。

1.2 试验方法

将储存在液氮中的胸肌组织迅速取出，放入干冰中，送往上海元莘生物公司进行RNA-seq 分析。

1.3 测序数据质量评估及比对

通过Illumina 平台测序后，得到样本双端测序数据。为保证后续生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行质量过滤，从而得到高质量的质控数据。

1.4 差异基因的筛选

利用DESeq 软件对各个样本基因的counts 数量进行标准化处理，计算差异倍数，并采用负二项分布检验的方式对reads 数进行差异显著性检验，最终根据差异倍数及差异显著性检验结果来挑选差异基因。

1.5 候选基因的RT-qPCR 验证

以β-actin为内参基因，利用qPCR 检测肉质差异表达基因在不同甘草多糖浓度组的肉鸡中的表达情况。实时荧光定量PCR 反应体系为20 μL：模板cDNA 1 μL，上下游引物各0.75 μL，SYBR R Premix ExTaqTM II（2X）10 μL，ddH2O 7.5 μL。

1.6 统计分析

基因的相对表达量采用2－ΔΔCt来计算，运用SPSS 20.0 软件进行t检验分析，用Graphpad prism 8.0 作图。

2 结果与分析

2.1 转录组测序结果

总的原始reads 数目为347.58 M，过滤后得到的CleanReads 数目为346.86 M，过滤后得到的总碱基数目为51.47 G。将6 个测得样本中至少87%的reads 均比对在参考基因组上，比对在参考基因组上有多个位点的reads 均低于5%。

2.2 差异表达基因分析

本研究共筛选出44 个差异表达基因，相较于0 mg/kg 的A 组肉鸡，900 mg/kg 的D 组肉鸡胸肌组织中上调基因有17 个，下调基因有27 个（图1）。

2.3 差异表达基因热图分析

将所有比较组合的差异基因集的并集在不同样品中的FPKM 值，用于层次聚类分析，以热图的方式展示不同样本中差异表达基因的差异情况（图2）。0 mg/kg 的A 组肉鸡3 个个体聚在一支，900 mg/kg的D 组肉鸡聚在一支，表明0 mg/kg 的A 组肉鸡和900 mg/kg 的D 组有明显的基因表达模式差异，从中筛选调控肉质的基因是可行的。

2.4 基因GO 分析

有15 605 个基因注释到GO 数据库中，共有41 个分类条目显著富集，生物学过程注释到21 个条目中，细胞组分注释到13 个条目中，分子功能注释到7 个条目中（图3）。

2.5 基因KEGG 通路富集分析

将所有基因进行KEGG pathway 分析，结果表明所有基因总共涉及55 条通路。其中，MAPK 信号通路、催乳激素信号通路、视黄醇的新陈代谢、金葡菌感染、全身性红斑狼疮、补体系统、丙型肝炎、吞噬体、麻疹中的蛋白多糖基因数目较多。

2.6 候选基因的RT-qPCR 分析

通过对得到的全部候选基因筛选，得到6 个与肉 质 相 关 的 基 因（LPL、PPARG、FABP3、CAPN2、CAST和UCP3），研究其在鸡分别饲喂0、900 mg/kg甘草多糖42 d 不同基因的表达水平。荧光定量结果显示：LPL、PPARG、CAPN2 和UCP3 基因在0 mg/kg甘草多糖组中的表达量高于900 mg/kg 组，FABP3、CAST基因在900 mg/kg 甘草多糖组中的表达量高于0 mg/kg 组。荧光定量所得结果与RNA-seq 筛出来基因表达结果一致，验证了RNA-seq。

3 讨 论

刘蒙等[7]认为日粮不同的代谢能水平影响LPL基因表达以及鸡脂肪沉积。本研究在爱拔益加肉鸡日粮中添加甘草多糖，结果表明900 mg/kg 的甘草多糖降低了鸡胸肌LPL基因的相对表达量。PPARγ基因的表达影响机体内脂肪细胞分化脂质代谢[8]。盘道兴等[9]认为猪在不同情况下体内脂肪沉积脂质代谢和PPARγ基因表达水平有关系。本试验说明甘草多糖影响了爱拔益加肉鸡PPARG基因的表达。邵勇钢等[10]研究表明，拜城油鸡公鸡的胸、腿肌肉中A-FABP基因的表达量差异不明显。H-FABP基因和脂肪组织发育以及功能有着很密切的关系，影响脂肪沉积[11]。L-FABP基因的表达量也受到营养因素影响，高脂的饲粮可增加大鼠L-FABP基因表达量[12]。本试验结果表明添加900 mg/kg 甘草多糖鸡胸肌FABP3 基因的相对表达量确有增加的趋势，但并不显著。

CAPNl 失去活性自溶是分子间过程，CAPN2 自溶是分子内过程，自溶可以让CAPN2 不是完全的失活。所以，CAPNl 是使蛋白降解造成肉得到嫩化重要的酶。本试验对鸡CAPN2 基因表达量的变化研究结果显示：900 mg/kg 的甘草多糖降低了鸡胸肌CAPN2 基因的相对表达量，但并不显著。Morgan等[13]研究表明，公牛的背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白活性有升高，肌肉蛋白质降解速度有降低，因此获得快速生长和高瘦肉率。Huang 等[14]认为CAST 在屠宰后肌肉中可以使钙蛋白酶活性受到抑制。本试验结果显示添加900 mg/kg 甘草多糖，鸡胸肌CAST基因的相对表达量增加，但并不显著。李香[15]研究鸡在急性偏热下基因UCP3 mRNA 的影响，试验结果表明随着温度的升高，鸡的胸肌UCP3 mRNA 表达降低，肝脏UCP3 mRNA 表达升高。本试验添加900 mg/kg 甘草多糖肉鸡胸肌中UCP3 基因相对表达量降低，关于UCP3 基因调控机制的报道都认为UCP3 基因为负向调控机制，与本试验结果一致。

本试验通过高通量测序技术，对日粮中添加0、900 mg/kg 甘草多糖的爱拔益加肉鸡的胸肌组织进行RNA-seq 分析，筛选得到与肉质相关的6 个差异表达基因，获得了候选基因的功能、分类及代谢途径，可为今后开展爱拔益加肉鸡肉品质相关基因的研究及分子调控机制提供参考。