黄晨凤，李淼

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科，沈阳 110004）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种异质性气道慢性炎症疾病，影响全球约3.34亿人，我国则有2 000余万人患有哮喘［1-2］。根据痰液炎症细胞的不同，哮喘可分为嗜酸性粒细胞哮喘、中性粒细胞哮喘（neutrophilic asthma，NA）、寡粒细胞哮喘和混合性粒细胞哮喘［3］。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是哮喘中常见的炎性细胞因子，而黏蛋白5AC（mucin 5 subtype AC，MUC5AC）过度表达被认为是哮喘气道黏液高分泌的标志，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threo-nine protein kinase，AKT）参与以上三者的形成过程。鱼腥草为食药同源中药，鱼腥草素钠（sodium houttuyfonate，SH）是鱼腥草素的化合物，具有抗炎作用［4］。既往研究［5］表明，SH能抑制哮喘气道高反应（airway hyperresponsiveness，AHR）及气道炎症。本研究拟探讨SH是否通过抑制AKT磷酸化减少炎性细胞因子及黏蛋白表达，从而缓解NA症状。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级Balb/c小鼠40只（购自北京华阜康生物科技股份有限公司），6～8周龄，体质量18～20 g。

1.1.2 主要试剂和仪器：卵清蛋白（ovalbumin，OVA）购自美国 Sigma公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、SH购自大连美仑生物公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；RNAiso Plus购自宝日医生物技术（北京）有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；兔抗TNF-α、GAPDH、AKT抗体、鼠抗p-AKT抗体购自美国Proteintech公司，鼠抗IL-1β抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，鼠抗MUC5AC抗体购自美国ThermoFisher Scientific公司。压缩空气式雾化器（403M，中国鱼跃医疗股份有限公司），qRT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，多功能酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型建立：将小鼠随机分为正常对照（NC）组、NA组、SH组、地塞米松（dexamethasone，DXM）组、联合干预（SH+DXM）组，每组8只。建立小鼠NA模型［6］，NC组小鼠鼻腔滴入20 μL生理盐水，其余组小鼠在实验第1、7、14天分别鼻腔滴入等量50 μg OVA+15 μg LPS的混合致敏液。实验第21～27天，对SH（10 mg/kg）组、DXM（2 mg/kg）组、SH+DXM（10 mg/kg+2 mg/kg）组小鼠腹腔注射相应剂量的药物，NA、NC组小鼠腹腔注射等量生理盐水，1 h后将除NC组以外的其他4组小鼠分批放置于雾化箱中，5% OVA溶液空气压缩雾化，30 min/次，1次/d；NC组小鼠用等量生理盐水雾化，余条件同前。

1.2.2 无创气道阻力检测：最后一次雾化激发48 h内，用DSI Buxco无创双腔检测系统检测各组小鼠的特殊气道阻力（special resistance of airway，sRaw）。

1.2.3 单肺灌洗及细胞计数：将小鼠麻醉后行单肺灌洗，将回收的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）离心（1 500 r/min，4 ℃）10 min，弃上清，加入200 μL 4%多聚甲醛重悬，吸取适量BALF滴在血细胞计数板上，镜下计数白细胞总数；另取适量BALF根据瑞氏吉姆萨染色液试剂盒要求操作，镜下分类计数白细胞。

1.2.4 标本采集：取小鼠右下肺，4%多聚甲醛固定，-80 ℃冻存，用于后续实验。

1.2.5 HE、PAS、Masson染色：将固定好的肺组织制成石蜡切片，根据相应试剂盒说明书进行染色，镜下观察各组小鼠气道、气道周围、气道黏膜下的生理病理形态。

1.2.6 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色：石蜡切片常规脱蜡至水，根据抗体说明书进行抗原修复，内源性过氧化物酶阻断剂灭活30 min，非特异染色阻断剂封闭30 min，加入MUC5AC抗体（1∶200稀释）4 ℃过夜，加入二抗孵育20 min，SABC孵育20 min，DAB显色。

1.2.7 qRT-PCR检测各组小鼠肺组织中MUC5ACmRNA表达水平：提取小鼠肺组织总RNA，按照试剂盒说明书反转录成cDNA，然后行PCR扩增。内参照β-actin正向引物序列5’-CTACCTCATGAAGATCCTG ACC-3’，反向引物序列5’-CACAGCTTCTCTTTGATGT CAC-3’；MUC5AC正向引物序列5’-ATCTGTAAGGA AGCCACGCTAA-3’，反向引物序列5’-CTCCTCGTA TGTGACTATCAGG-3’。qRT-PCR反应体系：qRT-PCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，Dye 0.4 μL，cDNA模 板2.0 μL，RNase-free H2O 6.8 μL，共20 μL。反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。用2-ΔΔCt法分析相对表达量。

1.2.8 Western blotting检测各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、p-AKT/AKT蛋白表达量：提取总蛋白，按照BCA试剂盒说明书进行蛋白定量，制备蛋白样品。经电泳、转膜、封闭，经一抗（TNF-α、IL-1β抗体稀释1∶1 000，GAPDH抗体稀释1∶10 000，p-AKT/AKT抗体稀释1∶3 000）4 ℃孵育、二抗（稀释1∶10 000）室温孵育后，ECL法发光显影。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件行统计学分析，符合正态分布的计量资料多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Dunnett’sT3检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。所有实验均重复3次以上。

2 结果

2.1 各组气道阻力比较

气道阻力检测结果显示，NA组小鼠的sRaw［（3.11±1.00）cmH2O·s］明显高于NC组［（0.85±0.06）cmH2O·s］，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；SH组［（1.46±0.12）cmH2O·s］、DXM组［（1.20±0.23）cmH2O·s］、SH+DXM组［（0.89±0.13）cmH2O·s］均低于NA组，差异有统计学意义（均P＜ 0.05）。

2.2 各组单肺灌洗及细胞计数比较

BALF白细胞总数计数结果显示，NA组BALF中白细胞总数［（352.75±56.96）×104/mL］高于NC组［（19.54±11.52）×104/mL］，差异有统计学意义（P＜0.01）。SH组、DXM组、SH+DXM组小鼠BALF中白细胞总数分别为（125.42±31.03）×104/mL、（55.96±10.29）×104/mL、（47.13±6.97）×104/mL，均高于NC组，但较NA组均明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；DXM组、SH+DXM组BALF中的白细胞总数较SH组均减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。

BALF瑞氏吉姆萨染色白细胞分类计数结果显示，NA组、SH组、DXM组的嗜酸性粒细胞数［（18.50±0.71）×104/mL、（9.42±0.58）×104/mL、（7.83±0.75）×104/mL］均高于NC组［（3.67±0.92）×104/mL］，中性粒细胞数［（71.08±5.93）×104/mL、（22.79±3.10）×104/mL、（5.79±0.89）×104/mL］亦均高于NC组［（2.17±1.10）×104/mL］，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；SH+DXM组的嗜酸性粒细胞数［（4.42±0.89）×104/mL］及中性粒细胞数［（3.71±0.51）×104/mL］与SH组、DXM组的嗜酸性粒细胞数及中性粒细胞数较NA组均明显减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；DXM组、SH+DXM组的嗜酸性粒细胞数及中性粒细胞数较SH组均减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。NA组、SH组、DXM组、SH+DXM组的巨噬细胞数分别为（36.42±11.44）×104/mL、（31.38±11.01）×104/mL、（21.29±4.57）×104/mL、（15.54±3.02）×104/mL，均高于NC组［（7.46±4.26）×104/mL］，淋巴细胞数分别为（26.58 ±8.04）×104/mL、（30.00±11.84）×104/mL、（17.92±3.59）×104/mL、（16.17±2.06）×104/mL，亦高于NC组［（5.13±3.71）×104/mL］，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。

2.3 各组肺组织和气道组织染色结果比较

HE染色显示，NC组小鼠气道无炎症表现，而NA组气道上皮细胞肥大、管壁增厚、管腔狭窄，肺组织及气道有明显的炎症细胞浸润，SH组、DXM组、SH+DXM组肺组织及气道炎症明显减轻。PAS染色显示，NA组小鼠气道有明显的黏液高分泌，NC组则几乎没有，SH组、DXM组、SH+DXM组分泌明显减少；Masson染色显示，NA组小鼠肺组织及气道黏膜下有明显的纤维化，NC组几乎没有纤维化发生，SH组、DXM组、SH+DXM组纤维化显著减少，见图1。

图1 各组小鼠肺组织及气道组织 HE、PAS、Masson 染色 ×200Fig.1 HE，PAS，and Masson staining of lung tissues and airway of mice in each group ×200

2.4 各组小鼠肺组织中黏蛋白和炎性细胞因子表达水平比较

IHC染色显示，NA组肺组织中MUC5AC的表达（0.076±0.022）明显高于 NC组（0.011±0.002），SH组（0.025±0.005）、DXM组（0.024±0.008）、SH+DXM组（0.021±0.003）的表达量较 NA组明显减少，见图2。

图2 各组小鼠肺组织及气道IHC染色 ×200Fig.2 IHC staining of lung tissue and airway of mice in each group ×200

2.5 各组小鼠肺组织中MUC5AC mRNA表达水平比较

qRT-PCR结果显示，NA组小鼠肺组织中MUC5ACmRNA表达水平（25.02±13.52）显著高于NC组（0.85±0.44），差异有统计学意义（P＜ 0.01），SH组（12.26±7.03）、DXM组（2.04±1.07）、SH+DXM组（5.17±2.81）均低于NA组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6 各组小鼠肺组织中炎性细胞因子表达水平比较

Western blotting结果显示，NA组小鼠肺组织中TNF-α蛋白相对表达量（1.38±0.17）高于NC组（1.00±0.69），SH组（1.01±0.10）、DXM组（0.85±0.12）、SH+DXM组（0.78±0.19）TNF-α相对表达量则 低于NA组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；NA组小鼠肺组织中IL-1β蛋白相对表达量（1.51±0.42）高于NC组（0.96±0.17），SH组（0.90±0.20）、DXM组（0.89±0.22）、SH+DXM组（0.80±0.30）IL-1β相对表达量低于NA组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图3。

图3 Western blotting检测各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β蛋白表达水平Fig.3 TNF-α and IL-1β protein expression levels in lung tissues of mice in each group detected by Western blotting

Western blotting结果还显示，NA组小鼠肺组织中p-AKT表达水平（1.51±0.30）高于NC组（0.75±0.10），SH组（0.99±0.31）、DXM组（0.80±0.28）、SH+DXM组（0.96±0.25）p-AKT表达水平低于NA组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图4。

图4 各组小鼠肺组织中 p-AKT/AKT蛋白表达水平Fig.4 p-AKT/AKT protein expression in lung tissues of mice in each group

3 讨论

NA是哮喘的表型之一［7］，其特征是多数中性粒细胞聚集于肺组织和气道，释放大量炎症介质（如TNF-α、IL-1β），从而引发炎症反应［8-9］。本研究发现，NA组小鼠sRaw、BALF中白细胞总数及中性粒细胞计数、肺组织TNF-α及IL-1β蛋白表达量均较NC组增加。研究［10］发现，MUC5AC在NA中高表达，IL-1β可增加人原代气道上皮细胞中MUC5AC表达。研究［11］表明，NA气道上皮细胞中TNF-α、MUC5AC 表达增加。本研究结果发现，NA组小鼠肺组织中MUC5ACmRNA及蛋白表达量较NC组增多。本研究结果还显示，SH组、DXM组、SH+DXM组小鼠肺组织中MUC5ACmRNA及蛋白表达量较NA组减少，说明SH、DXM及两者联合干预均可降低NA小鼠肺组织中MUC5ACmRNA及蛋白表达水平。

AKT是AGC蛋白家族成员之一，有研究［12］证明NA小鼠模型中AKT磷酸化信号增强。LI等［13］指出，TNF-α可能通过激活AKT磷酸化参与气道炎症。MA等［14］证实，车前草苷通过抑制AKT磷酸化降低MUC5AC及IL-1β的表达量。在本研究中，NA组小鼠肺组织中p-AKT/AKT蛋白表达量较NC组增多，SH组小鼠肺组织中p-AKT/AKT蛋白表达量较NA组明显减少，提示SH可以抑制NA小鼠肺组织中AKT磷酸化。

鱼腥草素是鱼腥草的主要活性成分。因SH较鱼腥草素注射液更安全稳定，故临床上通常使用SH。SH在多种细胞和动物模型中发挥抗炎作用，可抑制牛和小鼠乳腺上皮细胞中 TNF-α、IL-1β 的表达［15-16］；降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的水平［17］，可通过抑制p38、JNK和ERK通路的磷酸化来抑制NF-κB活 化。本研究中，SH组、DXM组、SH+DXM组小鼠的sRaw、BALF中白细胞总数及中性粒细胞计数、肺组织中TNF-α和IL-1β的蛋白表达量均低于NA组，提示SH、DXM及两者联合干预均可抑制NA小鼠的炎症。ZHU等［18］的研究结果表明，鱼腥草可抑制肺纤维化p-AKT/AKT的表达。本研究发现，DXM组、SH+DXM组小鼠肺组织中p-AKT/AKT的蛋白表达量较NA组减少，提示DXM干预、SH联合DXM干预均可抑制NA小鼠肺组织中AKT磷酸化。

综上所述，本研究发现SH可通过抑制AKT磷酸化，减少炎性细胞因子及黏蛋白的表达，缓解 NA的炎症表现，为NA的治疗提供了一种新的策略。