方越，刘新泉，苏晶

年龄相关性黄斑变性（age related macular degeneration，AMD）是老年人群中视力进行性或不可逆性丧失的主要原因[1]，发病率逐年上升[2]，严重影响患者生活质量。AMD 有2 种形式，其中干性年龄相关性黄斑变性（dry AMD，dAMD）最常见，约占AMD 总数的80%。寻找安全有效的治疗药物成为dAMD 研究亟待解决的问题[3]。在各种因素导致的氧化应激的作用下，视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞发生凋亡[4]，是dAMD进展的关键因素之一。中医学在治疗AMD 方面进行了长期广泛的临床实践，但是缺乏现代科学的理论依据。滋阴补肾片（Ziyin BushenTablet，ZYBS）是源于范氏眼科祖传配方，也是上海中医药大学附属龙华医院的院内制剂，至今已使用40余年。前期临床观察[5-6]发现，ZYBS 对dAMD 患者有一定疗效，但其药理作用机制尚不明确。基于此，本实验将通过碘酸钠（NaIO3）诱导的大鼠dAMD 模型，探讨ZYBS 对视网膜氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级5～6 周龄雄性SD 大鼠60 只，体重180～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司公司，实验动物合格证号[SCXK（沪）2019-0005]。饲养温度维持在20℃～25℃，昼夜节律，自由饮食饮水。本实验由上海中医药大学动物实验伦理委员会批准（伦理审批号：PZSHUTCM22080822）。

1.2 药品、试剂与仪器

ZYBS（上海中医药大学附属龙华医院），维生素E 软胶囊（上海信谊延安药业有限公司，03200701），活性氧（reactive oxygen species，ROS）、脂质氧化（superoxide dismutase，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（碧云天生物科技股份有限公司，S0033s、S0131S、S0073、S0101s），TUNEL 细胞原位凋亡试剂盒（瑞士Roche公司，12156792910），苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒（碧云天生物科技股份有限公司，C0105s），4%多聚甲醛（北京优尼康生物科技有限公司，P1110）。光学显微镜、冰冻切片机（德国Leica公司，DM2500、CMl850）。

1.3 建立dAMD大鼠模型

根据文献[7-8]和前期预实验结果，采用40 mg/kg的NaIO3鼠尾静脉注射建立dAMD 大鼠模型。注射7 d 后即可在视网膜组织学切片检查中见视网膜RPE、感光细胞和内层视网膜结构出现变薄、排列混乱等改变，提示造模成功。

1.4 分组与给药

将造模成功的50 只大鼠随机分为模型组（model group，MG）、阳性对照药维生素E 组（vitamin E group，VE）、低剂量ZYBS 组（LZYBS）、中剂量ZYBS 组（MZYBS）、高剂量ZYBS 组（HZYBS），另将尾静脉注射生理盐水的大鼠设为对照组（control group，CG），每组10 只。根据60 kg 成人体重与大鼠的等效剂量计算，维生素E 灌胃剂量为0.20 g/kg，LZYBS、MZYBS、HZYBS分别灌胃0.23、0.47、0.94 g/kg的ZYBS，CG、MG 组灌胃等体积蒸馏水，每日1 次，连续灌胃3周。

1.5 HE染色检测大鼠视网膜病理形态

引颈处死大鼠后快速摘除大鼠眼球，固定后沿角巩膜缘剪开，取视杯组织再次固定，分级脱水后石蜡包埋，沿眼轴方做连续4 μm切片，然后进行HE染色。光学显微镜下观察视网膜各层结构的变化，每组随机选取3 张切片，每张切片于200 倍放大倍数下选择5个不重叠的视野区域（以视神经为中心，两侧各选择2～3 个视野）并拍片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件。

1.6 TUNEL凋亡检测细胞凋亡

取材后制作视网膜石蜡包埋切片，按照TUNEL试剂盒说明进行相关检测后，荧光显微镜下观察，自视盘向锯齿缘方向连续取3 个视野，记录每个视野中染色阳性细胞数及感光细胞总数，抽样6 张不同切片，计算平均感光细胞凋亡率。细胞计数采用3Y-Pixel-PRO 分析软件，感光细胞凋亡率（%）=阳性细胞数／感光细胞总数×100%。

1.7 血清氧化应激指标检测

制备大鼠血清，按照试剂盒说明书检测大鼠血清ROS、MDA、SOD、GSH-Px 表达水平，在酶标仪405 nm处测定各孔吸光度值。

1.8 统计学方法

应用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验，当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZYBS对dAMD大鼠视网膜形态的影响

CG 组大鼠视网膜层次清晰，细胞排列整齐，外核层（outer nuclear layer，ONL）、内核层（inter nuclear layer，INL）细胞间连接紧密，与Bruch膜贴附良好。MG 组可见视网膜变薄，视网膜全层结构出现明显损伤，各层细胞排列紊乱，并出现波浪样改变，感光细胞层出现大量空泡，细胞外节段视不清，ONL、INL 细胞减少，与Bruch 膜间有空隙。相比CG组，MG、LZYBS、HZYBS 组大鼠视网膜仍见波浪样改变，MG、LZYBS 组视网膜各层细胞稀疏，排列紊乱，MG 组更为明显。而MZYBS、VE 组大鼠视网膜未见明显波浪样改变，ONL细胞可维持在大约7～8层，且细胞排列相对整齐（图1）。

2.2 ZYBS对dAMD大鼠视网膜细胞凋亡的影响

6 组间视网膜凋亡率比较，差异有统计学意义（F=291.813，P=0.000）。两两比较：与CG 组比较，MG组大鼠视网膜凋亡率升高，差异有统计学意义（t=59.619，P=0.000）；与MG组比较，VE、LZYBS、MZYBS 和HZYBS 组大鼠视网膜凋亡率降低，差异均有统计学意义（tVE=15.405，tLZYBS=9.157，tMZYBS=7.750，均P=0.000；tHZYBS=4.190，P=0.001）（图2、表1）。

表1 ZYBS对dAMD大鼠细胞凋亡和血清氧化应激指标的影响（，n=10）

表1 ZYBS对dAMD大鼠细胞凋亡和血清氧化应激指标的影响（，n=10）

注：*与CG 组比较，P＜0.05；#与MG 组比较，P＜0.05；CG 对照组；MG 模型组；VE 维生素E 组；LZYBS、MZYBS、HZYBS 低、中、高剂量ZYBS组；ZYBS 滋阴补肾片；dAMD 干性年龄相关性黄斑变性；ROS 活性氧；MDA 脂质过氧化物丙二醛；SOD 超氧化物歧化酶；GSH-Px 谷胱甘肽过氧化物酶

2.3 ZYBS对dAMD大鼠血清氧化应激指标的影响

6 组间大鼠血清ROS、MDA、SOD 和GSH-Px 表达水平比较，差异均有统计学意义（FROS=250.702，FMDA=229.167，FSOD=81.506，FGSH-Px=63.499，均P=0.000）。两两比较，（1）ROS：与CG 组比较，MG 组大鼠血清ROS 水平升高（t=25.662，P=0.000）；与MG 组比较，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 组大鼠血清ROS水平降低（tVE=18.093，tLZYBS=8.389，tMZYBS=26.990，均P=0.000；tHZYBS=3.097，P=0.006），差异均有统计学意义。（2）MDA：与CG 组比较，MG 组大鼠血清MDA 水平升高（t=25.165，P=0.000）；与MG 组比较，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 组大鼠血清MDA 水平降低（tVE=34.440，tLZYBS=21.221，tMZYBS=23.520，tHZYBS=29.590，均P=0.000），差异均有统计学意义。（3）SOD：与CG组比较，MG组大鼠血清SOD水平降低（t=11.401，P=0.000）；与MG 组比较，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 组大鼠血清SOD 水平升高（tVE=21.430，tLZYBS=16.192，tMZYBS=26.092，tHZYBS=15.931，均P=0.000），差异均有统计学意义。（4）GSH-Px：与CG 组比较，MG 组大鼠血清GSH-Px 水平降低（t=14.677，P=0.000）；与MG 组比较，VE、LZYBS、MZYBS、HZYBS 组大鼠血清GSH-Px 水平升高（tVE=15.762，tLZYBS=10.727，tMZYBS=7.008，均P=0.000；tHZYBS=2.247，P=0.037），差异均有统计学意义（表1）。

3 讨论

AMD 的典型病理变化，包括氧化应激和炎症引起的RPE 损伤和脂褐素沉积，目前普遍认为AMD的发生是易感基因、炎症反应、RPE 细胞氧化损伤、老化和代谢改变等多种因素参与的[10]。但是无论是衰老、光损伤还是吸烟，其中的氧化应激被认为是dAMD 的主要发病机制[10-11]。当各种因素引起氧化损伤时，视网膜产生大量的ROS，溶酶体结构受到破坏，RPE 细胞吞噬能力下降，导致脂质过氧化，可以产生超氧负离子、单态氧和H2O2等ROS，对RPE细胞造成损伤，并最终导致RPE 细胞的死亡，形成脂褐质，堆积在RPE 层和Bruch 膜下，参与玻璃膜疣的形成。维持适当的RPE 功能是治疗dAMD 的主要治疗目标。针对dAMD发病机制中的氧化损伤因素，本研究利用鼠尾静脉注射NaIO3进行造模，NaIO3是一种无机氧化剂，可引起视网膜的氧化应激反应，会先后引起RPE、感光细胞和内层视网膜的损伤，是目前dAMD 研究使用较多的一种模型[7-8]。针对该模型中氧化损伤因素，本研究参照文献[12]，选用具有抗氧化作用的维生素E 治疗做为阳性对照药。

中医学认为AMD属于“视瞻昏渺”的范畴，其本质是由脏腑精气不足所致，与肾、脾、肝关系最为密切。ZYBS 秉承“滋阴补肾健脾”的治则来治疗dAMD，此方中有熟地黄、制首乌、桑椹、女贞子、生地黄、白芍、山药、麦冬、五味子、泽泻，共10 味药。ZYBS 方中君药为熟地黄、制首乌，可滋阴补肾；臣药为桑椹、女贞子、生地黄、白芍，桑椹、女贞子兼为补阴药，两药合用，可增补阴益肝肾之功；白芍益阴养血；生地黄滋阴生津；方中山药、麦冬、五味子为佐药，补脾胃，使升发肃降功能正常运行而使水谷精微布散周身，因此目得水谷精微濡养；泽泻为方中使药，有利湿泻浊之功效，使方中补中有泻，诸药调和。已有实验[13-17]证实熟地黄、女贞子具有抗氧化、抗炎和脂质代谢多种药理作用。

本实验通过视网膜病理切片观察，MG组40 mg/kg的NaIO3造成了明显的视网膜结构损伤，在视网膜全层及RPE 层均可看到凋亡细胞，细胞凋亡率增高。与MG 组比较，ZYBS 治疗后，视网膜各层结构排列相对规整，视网膜外层感光细胞层数以及细胞核密度较MG组有不同程度改善，同时，TUNEL检测发现视网膜细胞凋亡率减少，提示ZYBS 对视网膜细胞凋亡有一定保护作用。本研究还发现ZYBS 在中剂量时能较好地降低大鼠视网膜的凋亡，而高剂量组细胞凋亡率高于中剂量组，推测ZYBS 部分中药可能存在炮制不当的问题（如制首乌），大剂量给药后引起了细胞毒性，其中原因还有待进一步深入研究。

在氧化损伤中，GSH-Px 可以催化还原H2O2和其他过氧化物，而SOD 可以将氧离子催化还原为H2O2，MDA 是脂质过氧化氢的终产物，这几个指标被广泛用于氧化损伤的检测。本研究检测了大鼠血清中ROS 和MDA 的含量，发现与CG 组相比，MG组大鼠视网膜血清内ROS和MDA水平升高，SOD和GSH-Px 水平降低，表明NaIO3诱导大鼠视网膜存在氧化应激状态。而给药ZYBS 后，与MG 组相比，ZYBS 各剂量组降低了大鼠血清内的ROS 水平。低、中剂量ZYBS 还可降低ROS 及MDA 水平，提示ZYBS 改善了NaIO3诱导的大鼠视网膜的氧化应激状态，减少ROS 及各种氧自由基对大鼠视网膜的损伤。

综上所述，本实验明确了ZYBS 可降低NaIO3诱导的dAMD 大鼠视网膜结构的损伤改变，抑制视网膜细胞凋亡，减轻氧化应激水平，可为dAMD的临床药物开发提供参考。