张雪玲，崔桂云，鲍 磊，林晓光，陈念东，王黎明

(1.徐州医科大学附属宿迁医院神经内科,江苏宿迁 223800;2.徐州医科大学附属医院神经内科,江苏徐州 221002)

脑出血是常见的脑卒中类型，发病率、致残率和死亡率均较高，随着老年化速度加快，脑出血的发病率在未来很长一段时间还会呈现继续攀升趋势，给社会带来沉重负担[1-2]。然而，其确切机制至今仍未阐明，因此，目前治疗手段仍有限，仅限于对症治疗减轻并发症，死亡率并未大大降低[3]。因此，进一步深入研究脑出血致病机制对于寻找可能的治疗靶点具有重要意义。据现有研究显示炎性反应参与脑出血继发性脑损伤过程，脑出血诱发的炎症级联反应加速形成水肿，进一步损害脑组织[4-5]。有研究显示，三磷酸腺苷(ATP)/腺嘌呤核苷酸受体2X-4受体(P2X4)/NOD样受体蛋白-3(NLRP3)信号轴在炎性反应中发挥重要作用，ATP是机体重要的供能物质，与P2X4结合后，可通过激活NLRP3炎症小体，促进白细胞介素-1β(IL-1β)成熟及分泌，而诱发炎症[6-7]。但此通路是否参与脑出血炎症损伤目前不得而知。据此，本研究以脑出血作为疾病模型，围绕继发性炎症损伤，探讨ATP/P2X4/NLRP3信号轴在其中所起的作用，以期提供新的研究思路和干预手段。

1 材料与方法

1.1 实验材料

8周龄雄性 C57BL/6小鼠48只，体重 18～22 g，在适宜环境中进行饲养，兔抗小鼠ATP、P2X4、NLRP3、GAPDH一抗和P2X4 受体激动剂5′-胞苷三磷酸二钠(cytidine 5′-triphosphate disodium salt,5′-CTP)购自美国Santa Cruz公司，IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8 ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Western blot试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司；电化学发光(ECL)试剂购自美国Bioworld Technology公司；P2X4受体抑制剂5-BDBD(SML0450)购自美国Sigma公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒及SYBR green PCR 试剂盒购自北京宝日医生物公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。ABI 7500荧光定量PCR仪、凝胶成像仪购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 小鼠脑出血模型构建

小鼠10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，小鼠大脑固定在立体定位仪，75%乙醇消毒头皮，暴露顶骨，取尾动脉血50 μL，随后用注射泵以5 μL/min速度注射至左脑纹状体，针头停留10 min，注射孔用医用骨蜡封闭，缝合头皮切口。

1.3 分组及干预方法

实验分组分为假手术组、模型组、5-BDBD干预组、5′-CTP干预组，每组12例。假手术组注射15 μL生理盐水，模型组模型构建30 min后注射15 μL生理盐水，5-BDBD干预组于模型构建30 min后给予腹腔注射15 μL 1 nmol/L 5-BDBD(DMSO溶解)，5′-CTP干预组于模型构建30 min后给予腹腔注射15 μL 5 nmol/L 5′-CTP(DMSO溶解)。

1.4 小鼠脑出血神经功能缺损评分(NDS)

在脑出血模型建立后第1、3、5、7天进行NDS评分，总分为18分：1～6分为轻度伤；7～12分为中度伤；13～18分为重度伤[8]。

1.5 脑含水量测定

第7天测试脑含水量，麻醉小鼠，不用灌注，直接取其头颅，剥离出脑组织。后迅速将脑组织分为病灶侧、病灶对侧和小脑，分析天平上称量，得到湿重。随后90 ℃干燥箱烘干24 h，再次称量，得到干重。脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6 脑组织炎症因子水平测定

建模成功后第1、3、5、7天取各组小鼠腹主动脉血，4 ℃、2 000 r/min离心15 min，取上清液。 ELISA法检测组织血清 IL-1β、TNF-α、IL-8 水平，严格按照试剂盒操作说明进行。

1.7 蛋白免疫印迹法(Western blot)测定P2X4和NLRP3表达水平

提取组织蛋白，BCA法测定总蛋白含量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗 P2X4、NLRP3(1∶1 000)于4 ℃孵育过夜。HRP标记山羊抗兔二抗(1∶4 000)室温孵育 2 h，ECL显影，使用ImageJ软件分析蛋白表达水平。

1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定P2X4和NLRP3 mRNA表达水平

TRIzol法提取组织总mRNA，分光光度计测总 RNA 浓度，分别测定260 nm与280 nm的吸光度(A)值，计算浓度和纯度，随后进行反转录反应，取总RNA 5 μg，引物 1 μL，加无 RNAase 水至12 μL，混匀，并依次加入5×buffer 4 μL、dNTP 2 μL、RNAase 1 μL、RNAase 抑制剂1 μL，总体积 20 μL。充分混匀，PCR仪中65 ℃ 孵育5 min，42 ℃ 孵育60 min，合成 cDNA。随后进行qRT-PCR检测，反应体系：cDNA 2 μL、正反向引物各1 μL、Master(ROX)(2×) 2 μL、FastStart Universal SYBR Green 10 μL、无RNAase水补足至20 μL，引物序列见表1，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。用 2-ΔΔCt计算各基因表达水平。

1.9 ATP水平测定

将脑组织按5 μL/mg 加入冰预冷的0.4 mol/L 高氯酸，超声匀浆；4 ℃ 12 000 r/min离心 15 min，取上清液，加入50%上清液体积的1 mol/L 碳酸钾-甲醇混合液(体积比 4∶1)，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液，用反相高效液相色谱法检测ATP水平。色谱柱：Liehrospher 100 RP-18；流动相：10 mmol/L KH2PO,缓冲液(pH 7.4)；流速：1.2 mL/min。检测波长：254 nm；检测时间6 min。-20 ℃冷冻保存。

1.10 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠不同时间点的NDS比较

与假手术组比较，模型组、5-BDBD干预组、5′-CTP干预组建模后第1、3、5、7天时的NDS均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，5-BDBD干预组各时间点NDS明显降低(P<0.05)，5′-CTP干预组各时间点NDS明显增加(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠不同时间点的NDS比较分，n=12)

2.2 各组小鼠脑含水量比较

与假手术组比较，模型组、5′-CTP干预组建模后第7天时的病灶侧脑含水量均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，5-BDBD干预组建模后第7天时的病灶侧脑含水量明显降低(P<0.05)，5′-CTP干预组明显增加(P<0.05)，各组小鼠病灶对侧和小脑含水量未见明显差异(P>0.05)。见表3。

2.3 各组小鼠炎症因子水平比较

与假手术组比较，模型组、5-BDBD干预组、5-BDBD干预组建模后第1、3、5、7天时的IL-1β、TNF-α、IL-8水平均明显增加(P<0.05)；与模型组比较，5-BDBD干预组以上指标在各时间点明显降低(P<0.05)，5′-CTP干预组以上指标在各时间点明显增加(P<0.05)。见表4～6。

表3 各组小鼠建模后第7天脑含水量比较

表4 各组小鼠不同时间点的IL-1β水平比较

2.4 各组小鼠P2X4和NLRP3表达水平

与假手术组比较，模型组、5-BDBD干预组、5′-CTP干预组建模后第7天时P2X4和NLRP3的蛋白及mRNA表达水平均明显上调(P<0.05)；与模型组比较，5-BDBD干预组以上指标在建模后第7天明显下调(P<0.05)，5′-CTP干预组明显上调(P<0.05)。见图1、表6、7。

表5 各组小鼠TNF-α水平比较

表6 各组小鼠IL-8水平比较

图1 各组小鼠P2X4和NLRP3蛋白Western blot

表6 各组小鼠建模后第7天P2X4和NLRP3表达水平比较

2.5 各组小鼠脑组织ATP水平比较

与假手术组比较，模型组、5-BDBD干预组、5′-CTP干预组建模后第7天时的ATP水平明显增加(P<0.05);与模型组比较，5-BDBD干预组建模后第7天时的ATP水平明显降低(P<0.05)，5′-CTP干预组明显增加(P<0.05)。见表7。

表7 各组小鼠建模后第7天P2X4和NLRP3 mRNA

3 讨 论

脑出血严重影响全球居民健康，且目前仍缺乏有效的治疗手段，现有研究显示脑出血后的继发性脑损伤过程中炎性反应起到助推器作用[8-9]。基于炎性反应在脑出血中的重要作用机制，目前已出现诸多针对炎性反应的新的潜在治疗方法，需要进一步深入研究。

ATP作为细胞能量代谢的主要来源，可作为细胞行使神经递质激活嘌呤能P2X 的受体，在炎症和免疫过程起作用[10-11]。本研究采用经典的注射自体血方法建立小鼠脑出血模型，综合运用血清学及分子生物学实验方法探究ATP/P2X4/NLRP3信号轴在脑出血继发性炎性反应中的作用，结果显示，与假手术组比较，模型组NDS、病灶侧含水量明显增加，表明小鼠在构建脑出血模型后脑组织出现明显水肿，认知功能明显下降。本研究显示，与假手术组比较，模型组ATP水平、P2X4、NLRP3的蛋白和mRNA表达水平均明显增加，表明P2X4、NLRP3有可能参与了脑出血后神经功能缺陷。同时，本研究发现，与假手术组比较，模型组IL-1β、TNF-α、IL-8水平均明显增加。IL-1β、TNF-α、IL-8均为目前最常研究的促炎细胞因子，可驱动炎症信号传递，释放促炎和消炎因子，这与此前研究结果较为一致[12-13]，表明脑出血后炎性反应明显增加，可能通过促进炎性反应而加重脑组织损伤。本研究在给予P2X4抑制剂5-BDBD后，NDS明显下降，病灶侧含水量明显减少，表明脑出血引起的脑水肿和神经功能缺陷得到明显改善，可能与脑出血继发性炎性程度明显减轻有关；本研究同时发现NLRP3表达和炎症因子水平也明显降低，表明机体炎症水平得到明显控制，脑组织损伤程度得到明显改善。有研究显示，ATP/P2X4通路可激活NLRP3 炎症小体，促使半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)激活，进一步促进炎症因子 IL-1β 释放，扩大炎性反应，使水肿进一步增大，进一步加剧炎性反应，而给予抑制剂后，其表达水平明显减轻，初步表明ATP/P2X4/NLRP3信号轴参与了脑出血后炎性反应调控过程，给予抑制剂可有效减轻炎症损伤[14-15]。为了更进一步证明ATP/P2X4/NLRP3信号轴的炎症调控作用，本实验设计将P2X4受体激动剂5′-CTP加入干预方案，结果显示，在加入激动剂后神经认知功能缺损和炎性反应进一步加重，提示P2X4表达水平上调可促进炎性反应，进而进一步损伤脑组织，更加充分证实了 ATP/P2X4/NLRP3信号轴参与脑出血炎性反应调节过程，并以P2X4作为治疗靶点可明显减轻脑出血后的炎症损伤，提示了其未来可成为治疗靶点的潜力。

综上所述，本研究发现ATP/P2X4/NLRP3信号轴参与脑出血炎症损伤过程，而且可通过阻滞其通路激活从而有效改善脑出血后炎性反应，减轻损伤，从而改善预后，本研究结果将为进一步理解脑出血继发性炎症损伤机制奠定实验基础，为系统性研究脑出血继发性炎症损伤的治疗手段提供了依据。