龚心琰，朱凌波，郑娟庆，龚剑萍

(浙江省义乌市中心医院心内一科 322000)

心脑血管疾病是目前中老年群体的常见病及多发病，多基于动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发生，机制较为复杂[1]。在AS形成的过程中，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可以损伤血管内皮细胞，使脂质及炎性细胞等在损伤区浸润，形成粥样斑块[2-3]。因此，目前研究认为减轻ox-LDL 引起的血管内皮细胞损伤是干预AS的有效靶点之一[4]。本研究选用的自组装短肽(self-assembling peptide，SAP)Sciobio-Ⅱ，是由16个氨基酸残基构成的一种可以仿细胞外基质(extracellular ma-trix，ECM)功能的生物支架纳米材料，能够模仿ECM与细胞因子、生长因子之间的相互作用，进一步影响细胞的增殖与分化[5]。目前，Sciobio-Ⅱ对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤是否具有保护作用，以及其可能的相互作用机制未见相关文献报道。因此，本研究采用脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC) 作为实验对象，通过体外实验，验证和探究Sciobio-Ⅱ 对ox-LDL 诱导HUVEC损伤的实验效应及其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

自组装短肽Sciobio-Ⅱ(序列：RLEVKADARLEVKADA-NH2)由成都赛恩贝生物科技有限公司赠送；ox-LDL(Cat号：20605ES05)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 640，Cat号：40308ES20)、Annexin V/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(Cat号：40305ES20)、鼠抗二抗抗体(批号：33201ES60)均购自上海翊圣生物科技有限公司；细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自上海碧云天生物技术有限公司(Cat号：C0043)；HUVEC购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/Notch 信号通路抑制剂 LY450139(Cat号：425386-60-3)购自美国MCE 公司。PBS(Cat号： SH30256.01)购自美国HyClone公司；DMEM高糖培养基(REF：12430047)购自美国Gibco 公司；RNA提取试剂(Cat号：79306)购自上海凯杰公司；血管内皮生长因子受体 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2,批号：ab237634)、Notch1(批号：ab52627)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批号：ab32124)、Bax(批号：ab32503)一抗抗体购自英国 Abcam公司；β-肌动蛋白(β-actin)一抗抗体(批 号：A5441)购自美国 Sigma 公司；Bax、Bcl-2、VEGF-2、Notch1引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表 1；qPCR(SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ)试剂盒(Cat号：RR820A)、PrimeScriptTM反转录试剂盒(Cat号：RR047A)购自日本TaKaRa公司；PCR扩增仪(型号Life ECO)购自杭州博日公司；荧光定量PCR仪(型号ABI7500)购自美国ABI公司；Western blot电泳系统购自美国 Bio-Rad 公司；凝胶成像系统(型号：e-Blot 100)购自德国易勃特生物科技有限公司。见表1。

表1 各基因引物序列

1.2 方法

1.2.1细胞培养及分组

HUVEC用含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培养基贴壁培养(CO2浓度为5%)，待细胞融合度为90%时(细胞计数约为2×107个)，移除培养基，传代后继续培养扩增，得到足够数量的细胞后(本实验传至第3代)接种在不同规格的培养板内并进行相应的分组处理。设置不同浓度(0、10、20、50、100、150、200、250、300 mg/L)的Sciobio-Ⅱ，分组处理细胞，筛选出最佳浓度进一步行后续实验，经预实验结果显示，Sciobio-Ⅱ浓度为150 mg/L时各组表型均较为显著。再根据给予含不同试剂的DMEM 完全培养基将细胞分5组：control组(PBS)、ox-LDL组(200 mg/L ox-LDL)、Sciobio-Ⅱ组(150 mg/L Sciobio-Ⅱ)、ALL组(200 mg/L ox-LDL+150 mg/L Sciobio-Ⅱ)、LY组(200 mg/L ox-LDL+150 mg/L Sciobio-Ⅱ+25 μmol/L VEGF/Notch信号通路抑制剂 LY450139)。

1.2.2刚果红染色

用PBS配制150 mg/L Sciobio-Ⅱ溶液，在25 ℃适宜条件下自组装24 h，分别于0、8、12、24 h时取5～10 μL前述溶液，滴于载玻片上，用配好的刚果红染液染色30 s，置于光镜下观察，分别拍照留存。

1.2.3细胞增殖能力的检测

HUVEC接种在96 孔培养板内(最外侧36个孔加入空白培养基)，每孔约3 000个细胞，每组6孔，8 h后镜下观察细胞贴壁情况，确认贴壁良好后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ等试剂，分别在0、24、48、72 h时加入CCK-8试剂盒的检测液，10微升/孔，按照CCK-8试剂盒说明书操作，继续培养4 h，使用多功能酶标仪于450 nm波长测定吸光度(A450)值，绘制曲线图。

1.2.4细胞凋亡的检测

1.2.4.1末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测

HUVEC培养后接种在24孔培养板上，每孔3×104个细胞，8 h后镜下确认细胞贴壁，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等试剂，处理48 h后，弃去细胞培养基并用PBS洗涤2次，加入TUNEL 试剂盒中的固定液(4%多聚甲醛)，固定20 min，加入PI，每孔50 μL，置于CO2培养箱中避光孵育60 min，PBS洗涤3次后封片，使用共聚焦荧光显微镜进行观察(激发波长为550 nm，发射波长为570 nm)，分别拍照留存，计算凋亡率。

1.2.4.2Annexin V/PI双染法检测

HUVEC培养后接种在6孔培养板上，每孔4×105个细胞，8 h后镜下确认细胞贴壁良好，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等试剂，干预48 h后，移除细胞培养基，PBS洗涤2次，加入250 μL 0.25%无乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞(37 ℃ 5% CO2培养箱孵育3 min)，离心(1 000×g，5 min)后弃上清液，加入195 μL Annexin V/PI结合液，轻轻重悬细胞，再加入5 μL Annexin V/PI结合液和10 μL PI，混合均匀，在室温下避光孵育15 min，使用流式细胞仪进行检测(Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光)，分析数据，计算凋亡率。

1.2.5蛋白免疫印迹(Western blot)试验

HUVEC接种、贴壁且融合度为 60%后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等试剂处理 48 h；加入 250 mL 含 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，使用 BCA 试剂盒进行蛋白定量[稀释 10 倍，使用酶标仪测定562 nm处吸光度(A562 nm)值]；采用 70～120 V 的恒压进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，待目的条带电泳至分离胶中间。300 mA 恒电流进行聚偏氟乙烯(PVDF)膜转印，转印结束后做好标记；加入Bcl-2、Bax、VEGFR-2、Notch1、β-actin一抗4 ℃孵育过夜；次日回收一抗，加入各自对应的二抗；回收二抗，洗膜后每张膜加入配好的化学发光液，在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带(压片式)。使用 Image-J 软件扫描各条带灰度值，根据灰度值计算蛋白表达水平。

1.2.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

HUVEC培养后接种在6 孔培养板，每孔4×105个细胞，8 h镜下确认细胞贴壁后，加入ox-LDL、Sciobio-Ⅱ、LY450139等试剂处理48 h，PBS洗涤2遍，提取总RNA(具体按试剂盒说明操作)，琼脂糖电泳检测RNA完整性，并确认各标本RNA合格后，取1 μg总RNA进行反转录PCR，制备cDNA，再进行RT-qPCR检测(SYBR法)，检测基因包括Bcl-2、Bax、VEGFR-2、Notch1，以 β-actin 为内参，使用2-ΔΔct法计算各基因的表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 自组装短肽形成结果

刚果红染色结果观察到Sciobio-Ⅱ动态的宏观自组装过程，开始自组装2 h时，镜下可见短肽形成多层疏松薄膜(图1A)；自组装 4 h后，层片状的薄膜形成片状松散状(图1B)；自组装12 h 后，片状薄膜的厚度较前增加，同时薄膜之间开始相互连接(图1C)；自组装24 h 后，较为致密的单层膜状结构已经形成(图1D)。

2.2 细胞增殖情况的比较

与control组比较，ox-LDL 组的A450值明显下降(P<0.05)；与ox-LDL组比较，Sciobio-Ⅱ组、ALL组的A450值升高，Sciobio-Ⅱ组明显高于ALL组(P<0.05)。见图2。

A：疏松薄膜(自组装2 h)；B：片状松散薄膜(自组装4 h)；C:薄膜相互连接(自组装12 h)；D：单层膜(自组装24 h)。

图2 各实验组细胞增殖情况

2.3 细胞凋亡率的比较

TUNEL法与Annexin V/PI双染法均发现，与control组比较，ox-LDL组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05)；与ox-LDL组比较，Sciobio-Ⅱ组和ALL组的细胞凋亡率明显下降(P<0.05)，Sciobio-Ⅱ组明显低于ALL组(P<0.05)。见图3。

2.4 各组Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1基因水平的表达

与control组比较，ox-LDL组细胞中Bax、Notch1的基因表达水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的基因表达水平降低(P<0.05)；与ox-LDL组比较，ALL组细胞中Bax、Notch1的基因表达水平降低，Bcl-2、VEGFR-2的基因表达水平升高(P<0.05)；与ALL组比较，LY组Bax、Notch1的基因表达水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的基因表达水平降低(P<0.05)。见图4。

A:TUNEL实验及定量分析(箭头所示为凋亡细胞)；B：Annexin V/PI双染流式细胞实验及定量分析。

2.5 各组Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1蛋白表达水平的比较

与control组比较，ox-LDL组细胞中Bax、Notch1的蛋白表达水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表达水平降低(P<0.05)；与ox-LDL组比较，ALL组细胞Bax、Notch1的蛋白表达水平降低，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表达水平升高(P<0.05)；与ALL组比较，LY组Bax、Notch1的蛋白表达水平升高，Bcl-2、VEGFR-2的蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图5。

A：Bax、Bcl-2；B：Notch1、VEGFR-2。

A：Western blot;B:Western blot定量分析。

3 讨 论

自组装短肽是近年新兴的一种多功能生物材料，其形成的纳米纤维支架可以模仿体内细胞生长的微环境，控制释放生长因子，从组织、细胞到信号因子，蛋白表达促进细胞和组织的原位修复和再生，具有高生物活性与高生物相容性，因而被广泛应用[5-7]。HUVEC已证实可通过多种途径在炎性细胞的黏附和迁移，以及新生血管的形成等病理生理过程中发挥作用，且结构和功能与动脉内皮细胞相似[8-9]。而ox-LDL可以增加血管内皮细胞对某些生长因子、细胞因子的表达和分泌，促进泡沫细胞的形成，抑制内皮依赖性血管松弛，诱导细胞凋亡和坏死，是内皮功能损伤的危险因素[10-11]。低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)通过氧化应激作用形成ox-LDL，ox-LDL可以与内皮细胞表面受体(LOX-1)特异性结合，引起内皮功能失调、损伤，是促进斑块形成的重要机制[2,12]。

为了明确Sciobio-Ⅱ 在ox-LDL 诱导血管内皮损伤中的作用，本实验以ox-LDL 刺激HUVEC 作为体外细胞模型，通过检测细胞增殖情况及细胞凋亡，可观察到ox-LDL刺激后HUVEC的增殖明显下降、细胞凋亡率则明显增加，说明ox-LDL 能够诱导HUVEC 发生损伤。在ox-LDL 刺激的基础上引入Sciobio-Ⅱ 后发现细胞增殖较ox-LDL组能明显恢复，细胞凋亡率下降，说明Sciobio-Ⅱ能够改善ox-LDL引起的HUVEC损伤,结合本实验研究结果表明其具体作用机制可能与Bax/Bcl-2通路有关。结合本课题组现有的研究结果，筛选探索Bax/Bcl-2相关信号通路，认为这一恢复作用的分子介导机制可能与VEGF/Notch信号通路相关。VEGF是已证实的能够在血管损伤及再生过程中发挥作用的一种生长因子，可以介导Notch信号通路，刺激信号通路中的Bax、Bcl-2基因，使Bcl-2基因表达水平增多，Bax基因表达水平减少，从而促进血管内皮细胞迁移、黏附及微血管网络的生成，抑制血管内皮细胞凋亡[13-15]。本实验结果显示在引入VEGF/Notch信号通路抑制剂后，Bax和Notch1的蛋白及基因表达水平升高，Bcl-2和VEGFR-2的蛋白及基因表达水平降低，说明Sciobio-Ⅱ是可以通过被激活的VEGF/Notch信号通路来减轻ox-LDL引起的HUVEC凋亡。

综上所述，自组装短肽Sciobio-Ⅱ通过激活 VEGF/Notch信号通路减轻 ox-LDL 诱导的血管内皮细胞损伤，这也可能是Sciobio-Ⅱ发挥细胞保护作用的机制与作用途径，今后可进一步开展体内实验来验证，并进一步研究其对动脉粥样硬化的预防或延缓作用，为临床治疗提供新的思路。