杨 丽，张俊峰

(上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科 200011)

心血管疾病是全球主要死亡原因之一[1]。糖尿病是心血管疾病和缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)最重要的危险因素，心血管疾病合并糖尿病患者的病死率是非糖尿病患者的2～6倍。心肌再灌注往往引起心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[2]。糖尿病患者较健康人群发生MIRI的比例明显升高[3]。糖尿病和IRI都可诱导心肌细胞氧化应激和凋亡。橙皮素具有显著的抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。研究报道橙皮素在脑、视网膜等器官IRI过程中具有保护作用[4-5]，而在糖尿病MIRI(D-MIRI)中的报道较少。本研究拟探讨橙皮素在D-MIRI中是否抑制氧化应激及心肌细胞凋亡，从而发挥保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

雄性家兔24只，体重2.0～2.5 kg，购于上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004，饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房。本研究经本院动物伦理委员会批准，并遵守3R保护原则进行实验。

1.1.2试剂与仪器

橙皮素购自上海迈瑞尔化学技术有限公司(M18402-25G)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；末端DNA转移酶dUPT缺口末端标记(TUNEL)试剂盒和蛋白酶K购自武汉赛维尔生物科技有限公司；DAB显色剂购自德国DAKO公司。脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；烤箱(上海福玛实验仪器有限公司)；载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)；涡旋混合器(武汉赛维尔生物科技有限公司)；移液枪(中国北京Dragon公司)；显微镜(日本尼康Eclipse Ci-L)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病兔造模

糖尿病兔模型制备方法：家兔禁食12 h，经耳缘静脉注射5%四氧嘧啶2 mL。每天上午抽取禁食12 h的家兔耳缘静脉血进行血糖检测，直到血糖持续7 d高于11.1 mmol/L，表明糖尿病兔模型建立成功。糖尿病兔自由饮水，单笼普食饲养,饲养2周后制备MIRI模型。

1.2.2兔MIRI造模

由于兔心肌冠状动脉左前降支较大鼠粗，制作MIRI模型成功率高，故该实验选用兔心肌制作MIRI模型。方法参考文献[6]，采用冠状动脉左前降支结扎术构建兔MIRI模型。通过腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)将兔麻醉。仰卧位固定在手术台上,气管插管辅助通气。在胸部左侧的第3～4肋间切开皮肤，然后钝性分离，剥离肌肉，露出心脏。在左心耳下方1～2 mm处,以5-0无损伤缝合线在左冠状动脉前降支下穿线,进针深度约1.5 mm，将缝线线节穿过内径0.2 cm、长1 cm的硅胶管,避免结扎线切割血管，造成血管损伤，稳定10 min后束紧结扎线,行左冠状动脉缺血30 min,然后松开结扎线取出硅胶管；进行再灌注180 min。缺血成功的标准:结扎线以下心肌组织发绀。再灌注成功的标准:心肌局部反应性充血。

1.2.3动物分组

24只家兔随机分为对照组、D-MIRI组、低剂量橙皮素+D-MIRI组(L-HSP+D-MIRI)、高剂量橙皮素+D-MIRI组(H-HSP+D-MIRI)，每组6只。除对照组，其余各组按上述方法制备兔D-MIRI模型。参照文献[7]方法，L-HSP+D-MIRI组再灌注结束后开始应用橙皮素25 mg·kg-1·d-1灌胃干预1周。H-HSP+D-MIRI组再灌注结束后开始应用橙皮素50 mg·kg-1·d-1灌胃干预1周，其余2组应用等量生理盐水灌胃干预。

1.2.4标本采集

1周后，将家兔处死，完整取出心脏，分离出左心室。将兔左心室分为3部分，一部分心肌组织用于SOD和MDA的检测；一部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定行苏木素-伊红(HE)染色；最后一部分心肌组织于液氮速冻后，置于-80 ℃中保存，行心肌TUNEL检测。

1.2.5氧化应激指标检测

取部分缺血心肌组织，冰水浴条件下，机械匀浆，制备成10%的匀浆液，2 500～3 000 r/min，离心10 min，取上清液进行测定。根据SOD和MDA试剂盒说明书分别测量SOD和MDA水平。其中SOD水平用黄嘌呤氧化酶法，MDA水平用硫代巴比妥酸法。

1.2.6HE染色观察心肌组织病理变化

取出固定在多聚甲醛中的心肌组织，梯度乙醇脱水透明，石蜡包埋，然后将组织切成5 μm厚的切片，HE染色后于光学显微镜下观察心肌组织的病理学变化。

1.2.7TUNEL法检测家兔心肌组织细胞凋亡

取出保存在-80 ℃冰箱中的兔心肌组织行TUNEL检测，使用TUNEL试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1507)对心肌细胞的凋亡情况进行检测。具体步骤如下：兔心肌组织制备冰冻切片，切片厚度为8～12 μm。滴加适量TUNEL反应液，37 ℃温箱孵育30 min。将切片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片甩干后滴加新鲜配制的DAB显色液，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染约3 min。最后脱水、中性树胶封片。每个标本计数8个高倍镜(×200)视野内的所有阳性细胞数和所有细胞数，细胞凋亡率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。每张切片由2名观察者分别读片，计算平均值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组兔心肌组织中氧化应激指标的比较

D-MIRI组、L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组心肌组织SOD水平低于对照组(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组高于D-MIRI组(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI组高于L-HSP+D-MIRI组(P<0.05)。D-MIRI组、L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组心肌组织MDA水平高于对照组(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组低于D-MIRI组(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI组低于L-HSP+D-MIRI组(P<0.05)。见表1。

表1 4组家兔心肌组织SOD、MDA及细胞凋亡率变化

2.2 各组家兔心肌组织的病理变化

对照组心肌未见明显变性，排列规则，肌丝相对完整，细胞间隙均匀。D-MIRI组心肌组织水肿明显，排列不规则，肌丝不完整，细胞间隙增大，不均匀。L-HSP+D-MIRI组心肌组织水肿，排列尚规则，肌丝尚完整，细胞间隙增大，不均匀，较D-MIRI组症状轻。H-HSP+D-MIRI组心肌组织稍水肿，排列规则，肌丝尚完整，细胞间隙增大，尚均匀，较L-HSP+D-MIRI组症状轻。见图1。

2.3 各组家兔心肌组织细胞凋亡变化

采用TUNEL法检测各组心肌组织细胞凋亡变化，光镜下可见TUNEL染色阳性细胞表现为棕黄色。D-MIRI组、L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组心肌细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。L-HSP+D-MIRI组、H-HSP+D-MIRI组心肌细胞凋亡率低于D-MIRI组(P<0.05)。H-HSP+D-MIRI组心肌细胞凋亡率低于L-HSP+D-MIRI组(P<0.05)。见表1、图2。

A：对照组；B：D-MIRI组；C：L-HSP+D-MIRI组；D： H-HSP+D-MIRI组；黑色箭头表示心肌细胞肿胀、细胞间隙增大等组织病理学改变。

A：对照组；B：D-MIRI组；C：L-HSP+D-MIRI组；D： H-HSP+D-MIRI组；黑色箭头表示凋亡细胞。

3 讨 论

糖尿病引起的心血管疾病是人类高死亡率的重要原因之一，D-MIRI的发病率逐年上升。糖尿病可引起内皮功能障碍、胰岛素抵抗、心肌代谢异常等多种功能障碍。与非糖尿病患者比较，糖尿病患者患心血管疾病的风险增加了2～4倍[8]。此外，在急性MIRI的临床情况下，糖尿病患者的临床预后更差，包括急性心肌梗死、冠状动脉血管成形术，提示糖尿病患者可能更容易发生急性MIRI[9]。MIRI的病理生理机制可能与氧化应激、炎性反应、酸中毒、线粒体功能失调、心肌纤维能量代谢障碍等相关,其中氧化应激反应在MIRI中至关重要[10]。

IRI通常与微血管损伤有关，特别是毛细血管和小动脉的通透性增加，从而导致组织间质扩散和液体过滤增加。缺血后，血液重新进入组织，导致大量氧自由基的释放。这些氧自由基引发酶促反应，导致细胞膜的氧化损伤，以及有毒代谢物的产生和涉及DNA、蛋白质和脂类的细胞损伤。氧化应激与糖尿病及其并发症密切相关，表现为活性氧(ROS)的过量产生和抗氧化酶的消耗[11]。过量的ROS可破坏细胞和线粒体的双层膜，引起膜脂质过氧化反应，这被认为是导致线粒体和细胞功能障碍，特别是细胞凋亡的主要机制[12]。

糖尿病心肌ROS生成的增加是糖尿病心肌病发生发展的重要因素[13]。高血糖可导致ROS的产生增加，最终导致血管功能障碍。高血糖引起的氧化应激导致肌肉和脂肪细胞摄取葡萄糖不足。此外，高血糖引起的氧化应激可促进β细胞功能障碍，减少β细胞分泌胰岛素[14]，这样也会导致高血糖进一步加重。在高血糖状态下，ROS聚积，破坏DNA和蛋白质，损伤心肌细胞。同时，高血糖引起的ROS积累可引发胰岛素抵抗。当肌肉、脂肪和肝脏中的细胞对胰岛素没有适当的反应，并且不能从血液中摄取葡萄糖以获得能量时，就会发生胰岛素抵抗。因此，胰腺会产生更多的胰岛素,这些特征共同构成了心血管疾病的主要风险。高血糖引起的氧化应激在心血管功能障碍中发挥着重要作用，两者相互作用、相互影响[15]。MDA是脂质过氧化产物，可进一步诱导ROS的产生，抑制抗氧化系统，加重损伤。SOD可清除ROS，增强抗氧化系统，保护心肌细胞。机体内SOD及MDA水平可间接反映机体的抗氧化应激能力和细胞受氧化损伤的严重程度。

心肌细胞凋亡是心肌在病理因素的作用下发生的主动而有序的程序性死亡。IRI的发病机制是多因素性的,细胞凋亡是IRI的主要致病机制之一。心肌细胞是不可再生的细胞,心肌细胞凋亡会导致心肌收缩功能障碍。因此,抑制心肌细胞凋亡是减轻心肌梗死患者心肌损伤的有效途径之一。缺血会引起心肌细胞凋亡,再灌注则会进一步加重心肌细胞凋亡,抑制心肌细胞凋亡有助于减轻IRI对心脏的损伤。糖尿病加重MIRI的发病机制尚不完全清楚。糖尿病可导致ROS的过度产生，当MIRI发生时，离子通道开放(如K+外排)增加ROS的产生，在D-MIRI过程中，过度氧化应激可诱导心肌细胞凋亡、坏死和炎性反应，是MIRI的发生机制[16]。糖尿病模型中，激活AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)可能对IRI引起的心脏损伤具有保护作用。研究表明，糖尿病通过下调BAG3/Bcl-2/Nrf-2/HO-1的表达，增加p22/p67/Caspase 3/PARP表达介导氧化损伤，加重了IRI诱导的心肌功能障碍[17]。

橙皮素主要来源于芸香科柑橘属幼果，属于二氢黄酮中的一种,呈淡黄色针状结晶或粉末。难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。橙皮素是柑橘果皮中主要药理活性成分，其主要治疗作用是抗氧化和自由基清除[18]。LI等[19]研究发现，橙皮素可上调SOD表达，发挥抗氧化作用。橙皮素的抗氧化作用与清除自由基和增强抗氧化防御系统有关[20]。研究表明橙皮素可减少脂多糖诱导的H9C2心肌细胞线粒体依赖性细胞凋亡[21]。本研究中，橙皮素明显提高了D-MIRI兔心肌组织中的SOD水平，降低MDA水平和心肌细胞凋亡率，表明橙皮素可抑制D-MIRI兔的氧化应激反应和心肌细胞凋亡，与之前的研究结果一致。

综上所述，橙皮素可能是一种治疗D-MIRI的潜在药物，通过抑制心肌细胞氧化应激和凋亡，从而对MIRI发挥保护作用。本研究结果进一步丰富了橙皮素治疗糖尿病患者心肌MIRI的理论基础，为研究橙皮素抗心肌氧化应激、细胞凋亡的分子机制奠定了基础。橙皮素处理后可以同时抑制心肌氧化应激和细胞凋亡，产生保护作用，但是哪一个机制在D-MIRI中发挥主要作用仍不清楚，需要更进一步的实验研究证明。