刘欣欣 姚欣卉 孙跃峰 缪美琪 综述 陈晶 审校

乳腺癌是当今女性最常见的癌症类型，也是全球女性癌症死亡的主要原因[1]。肿瘤的生长过程不仅受自身内部信号的调控，也受肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的影响[2]。趋化因子在肿瘤调控中扮演着重要角色。趋化因子是一类小分子生物活性肽，可招募多种细胞直接迁移至肿瘤组织中，并作为促炎症介质调节TME，促进血管生成，诱导肿瘤迁移并加速肿瘤的发生发展、侵袭和转移[3]。CCL20是趋化因子大家族中的一员，是多种疾病中极具潜力的生物标志物及治疗靶点[4]。已有研究证实，CCL20与乳腺癌发展密切相关。CCL20与其受体CCR6结合后，诱导免疫细胞迁移、血管生成及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，影响TME，从而促进乳腺癌的浸润及转移[5]。以往对肿瘤的治疗多局限于肿瘤本身，探究TME的治疗价值是近年来的热门话题，而CCL20在TME中影响乳腺癌发生发展的机制尚未明确。因此，了解CCL20在乳腺癌发生发展中的作用，有助于探索乳腺癌的新诊疗靶点。本文就CCL20调控乳腺癌微环境的作用机制进行综述，以期能更好、更加全面地了解趋化因子CCL20在乳腺癌发生发展过程中扮演的角色，为乳腺癌的治疗提供新靶点。

1 乳腺癌微环境概述

乳腺癌的发生发展是一个复杂的过程，不仅取决于癌细胞本身，而且与其所处的TME中的某些细胞和胞外基质相关。乳腺癌TME中除了肿瘤细胞外，还有很多其他成分，包括肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、细胞外基质及信号分子等，这些成分构成了一个复杂的网络体系，可以精确调节肿瘤的发生以及肿瘤细胞与其他成分的相互作用[6]。具体来说，在TME中肿瘤相关成纤维细胞，通过分泌多种因子和金属蛋白酶等方式促进肿瘤的发生发展[7]。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)通过分泌大量的细胞因子和生长因子激活促炎通路等途径促进癌细胞增殖、迁移、侵袭等，并通过诱导癌细胞的耐药性的产生及逃避免疫抑制而促进癌症的发展[8]。TME中的血管内皮细胞则能通过建立微环境内的新生血管使肿瘤细胞免受缺氧损害，同时也能够帮助构建淋巴管以利于肿瘤细胞的转移[9]。

2 趋化因子CCL20及其受体CCR6的概述

2.1 趋化因子家族成员及功能

趋化因子是一类由多种细胞产生的分子生物活性肽，分子量约为8～14 kDa，根据N末端保守的半胱氨酸残基的位置，分为CC、C、CXC和CX3C四类亚族[10]。在TME中，多种肿瘤细胞和基质细胞可以分泌趋化因子。趋化因子不仅能够在肿瘤细胞中表达，也能够在肿瘤细胞附近的宿主细胞和转移灶中表达。趋化因子受体是典型的G蛋白偶联蛋白，主要表达于内皮细胞、免疫细胞和部分肿瘤细胞中。最近的证据表明，趋化因子及其受体的定向结合能够直接影响肿瘤细胞的增殖、迁移、血管生成、侵袭和转移，调控白细胞浸润进而影响抗肿瘤免疫活性，并介导肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用[11]。在肿瘤生长及转移过程中，趋化因子能够提供化学趋化信号，促使细胞迁移至远处器官。而血管新生的过程会受到许多血管生长因子及趋化因子家族成员调控。趋化因子的某些特定成员可以作为促血管生长因子，通过招募中性粒细胞合成和储存促血管生成因子驱动血管生成。此外，趋化因子负责包括巨噬细胞在内的各种类型的白细胞的肿瘤浸润。其中白细胞浸润的数量及类型取决于TME中趋化因子的种类和浸润细胞表达的受体[12]。文献研究显示，CC趋化因子的表达是巨噬细胞和淋巴细胞浸润的重要因素[13]。因此，趋化因子及其受体是肿瘤细胞与TME通信的关键介质。

2.2 CCL20及其受体CCR6的结构及生物学功能

CCL20属于CC亚家族的趋化因子，又被称为巨噬细胞炎症蛋白3α、肝脏活化调节趋化因子和Exodus-1，在肝脏中首次发现，能够与受体结合吸引淋巴细胞[14]。Nelson等[15]研究发现MIP3α/CCL20基因定位于2号染色体2q35～q36区域上，包含4个外显子和3个内含子，同时观察到CCL20的受体CCR6在抗原特异性激活T淋巴细胞时表达水平显著增加。CCL20包含96个氨基酸的开放阅读框，含有一个经典的N端信号肽序列，该基因包含如NF-κB转录因子的结合位点。CCL20主要表达在肝脏、肺及外周血细胞等部位，其专属受体为CCR6。CCR6 属 G 蛋白偶联的 7次跨膜的孤儿受体超家族，主要表达于未成熟树突状细胞、B细胞、T细胞及多种肿瘤细胞，参与细胞信号转导[16]。CCL20生理条件下表达较低的基础水平，经促炎信号诱导其表达升高。CCL20可趋化CCR6+细胞向抗原出现的组织部位定向迁移。另外，CCL20通过与其受体特异性结合，可能参与炎症及免疫反应过程，即一方面刺激机体发生适当的免疫反应，抵御微生物入侵，另一方面介导病理学组织损伤，从而构成了一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的生物学轴[17]。此外，CCL20与CCR6结合后可引起细胞内骨架蛋白的聚合与分布，调节肿瘤细胞运动与迁移，阻断CCR6/CCL20通路可能会降低恶性肿瘤转移的发生，这正是CCL20在抗肿瘤上发挥重要作用的主要原因[18]。

3 CCL20在乳腺癌微环境中的作用

3.1 逃避免疫监视

癌细胞逃避宿主免疫反应的能力是癌症进展的标志。CCL20能够招募促肿瘤免疫抑制细胞如调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)到TAMs中，以利于肿瘤逃避免疫监视，促进肿瘤发展。CCL20与其受体结合，能够招募树突状细胞到上皮组织中，这往往和肿瘤的预后差相关；进一步研究发现，这些浸润的树突状细胞能够重新编程，使Toll样受体7功能受到抑制，导致肿瘤组织中细胞因子谱的变化以及肿瘤的免疫逃逸，从而证实了CCL20在调节局部免疫中的巨大作用[19]。已有学者研究发现，CCL20与FOXP3在乳腺癌中共同表达与其预后不良密切相关。FOXP3是一种特异性的生物标志物，主要用于识别炎症浸润中的Tregs，在Tregs的发育和功能中发挥重要作用[20]。Zhao等[21]研究发现，随着肿瘤中浸润的FOXP3和Tregs数量增加，能够减少肿瘤细胞的免疫应答能力，促进乳腺癌的发展。另外，CCL20与CCR6协同抑制CD8+T细胞分泌的干扰素-γ的表达，增强乳腺癌的免疫抑制能力[22]。相关研究显示，CCL20的过表达与未成熟树突状细胞向乳腺癌组织浸润增加有关，CCL20能招募未成熟树突状细胞到肿瘤组织中，与Toll样受体7结合，诱导肿瘤细胞因子特征的改变，以损害免疫反应并进一步诱导免疫耐受[23]。

3.2 促进血管生成

CCL20在血管生成中发挥重要作用，血管生成是影响肿瘤新生血管形成的关键因素。肿瘤的生长需要新血管的生成以保证足够的供氧及营养物质，一旦缺氧可上调一系列促血管生成因子的表达，诱导肿瘤血管的新生。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)与血管内皮细胞的增殖密切相关，是新血管生成的关键因素。CCL20通过招募内皮细胞，刺激VEGF促进血管生成。研究表明，在缺氧微环境中，乳腺癌细胞通过上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)，刺激VEGF产生，诱导新生血管形成，使其适应缺氧环境，促进乳腺癌转移[24]。此外，研究发现乳腺癌中TAMs的调控与CCL20的表达相关，巨噬细胞浸润可分泌包括VEGF在内的多种促血管生成因子，促进血管生成[25]。

3.3 促进乳腺癌细胞侵袭转移

EMT是肿瘤细胞侵袭和转移的关键步骤，该过程发生在肿瘤的前期阶段，肿瘤细胞通常会失去原有的上皮细胞的特性，转化为间充质样细胞，从而提高肿瘤的侵袭转移能力[26]。在EMT过程中上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白表达下降，N-钙黏蛋白、波形蛋白等间质标志物表达上升[27]。此外，EMT能够增加基质金属蛋白酶(MMPs)的表达。通常情况下，MMPs能够降解细胞外基质和基底膜，促进肿瘤转移[28]。MMPs特别是MMP-2、MMP-9活性的增强是乳腺癌侵袭的重要步骤，二者的过表达与乳腺癌患者生存率降低相关[29]。Muscella等[30]研究发现CCL20可通过蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)、Src及下游Akt、JNK和NF-κB信号途径诱导EMT相关分子表达，促进乳腺癌细胞迁移，并发现较高浓度的CCL20能够活化PKC和ERK1/2MAPK通路促进细胞增殖。Marsigliante等[31-32]发现CCL20能够诱导乳腺上皮细胞的迁移和增殖，并通过体外实验研究发现，阻断CCL20可降低波形蛋白、N-钙黏蛋白和Snail的表达，而Snail可下调E-钙黏蛋白的表达。此外，研究表明CCL20参与EMT过程，主要通过抑制NF-κB、PKC和雷帕霉素的哺乳动物靶点(mTOR)，下调CCL20诱导的波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达，说明CCL20不仅能够增加Snail蛋白的表达水平，而且在EMT的调控中对E-钙黏蛋白具有抑制作用，并发现Snail蛋白的表达与肿瘤分化程度呈负相关，且与乳腺癌预后不良有关。TGF-β是一种免疫抑制细胞因子，对不同的免疫应答有抑制作用。TGF-β信号通路是介导调控EMT过程的信号通路，该通路在EMT的调控中能够促进乳腺癌的转移，TGF-β与其表面受体结合后激活Smad2和Smad3蛋白，进而上调Snail/Slug、ZEB1/2和Twist等EMT转录因子[33]。据报道，CCL20能够增强三阴性乳腺癌细胞系中基质蛋白酶MMP2和MMP9的表达，从而提高肿瘤迁移过程中所需的降解底层基底膜能力[34]。

3.4 化疗耐药

化疗耐药一直是三阴性乳腺癌临床治疗过程中亟待解决的重大问题。研究表明，乳腺癌干细胞与化疗耐药有关[35]。乳腺癌干细胞有较强的药物抵抗能力，通过分泌特定的细胞因子招募骨髓来源的抑制细胞、巨噬细胞等，以利于自我生存和自我更新。Chen等[36]通过体内外实验发现，紫杉烷类药物能够显著诱导CCL20的产生，CCL20的过表达促进了三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭性，并加速了异种移植模型中肿瘤的生长，进一步促进乳腺癌干细胞的自我更新和干性特征，导致肿瘤干细胞群体的扩增，增强其对紫杉烷类药物的抵抗能力，从而导致三阴性乳腺癌的化疗耐药。此外，研究发现，PKC和p38 MAPK以平行的方式传递CCL20信号，并共同促进下游的丝裂原激活蛋白激酶激活NF-κB，从而提高乳腺癌干细胞的自我更新能力和群体比例，促进三阴性乳腺癌肿瘤细胞的化学耐药。深入研究发现，CCL20及NF-κB之间存在正反馈调节，CCL20激活NF-κB后，能够刺激ABCB1的转录，增加其表达水平，使紫杉烷类药物流出细胞，从而增强癌细胞的耐药性[37]。

综上所述，CCL20能够增强乳腺癌细胞的化疗抵抗力，靶向CCL20的下游通路(如NF-κB)可以显著提高乳腺癌患者尤其是三阴性乳腺癌的治疗效果。因此，针对CCL20的方向采取干预措施可以提高乳腺癌的化疗效果。

3.5 与其他细胞因子在乳腺癌微环境中的协同作用

研究显示，CCL20的表达与RNA结合蛋白HuR(Human antigen R，HuR)、Cbp/p300结合转化激活因子含Glu/Asp丰富羧基末端域2(CBP/P300-interacting transactivator，with GLU/ASP-rich c-terminal domain-2，CITED2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)呈正相关。相关研究显示，CITED2与CCL20协同作用于乳腺癌的TME，促进肿瘤的发生发展。Jayaraman等[38]通过沉默CITED2发现，乳腺癌MDA-MB-231细胞中CCL20 mRNA的蛋白表达显著降低，同时可减少MDA-MB-231的浸润，说明CCL20与CITED2协同调节巨噬细胞的招募，从而影响肿瘤生长。乳腺癌常发生的骨转移以溶骨性转移为主。研究显示，趋化因子能够极大地促进骨细胞和破骨细胞之间的相互作用，破坏骨组织，加速骨溶解，使肿瘤细胞不断增殖[39]。据报道[40]，HuR下调可抑制乳腺癌骨转移的发生。而Lee等[41]研究发现，CCL20显著促进基底样三阴性乳腺癌细胞的细胞侵袭和MMP-2/9分泌，证实了CCL20在乳腺癌骨转移中的作用，且通过上调HuR基因，能够使CCL20高表达，从而促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及荷瘤小鼠的溶骨性骨转移。此外，在三阴性乳腺癌细胞系中沉默CCL20或HuR均可显著降低肿瘤的生长且对肿瘤的调控具有协同作用。另一项研究显示，肿瘤坏死因子TNF-α能够强有力地刺激CCL20的表达。Kim等[42]研究发现，脂肪细胞分泌的未知蛋白诱导TNF-α的产生，导致乳腺癌细胞MDA-MB-231中CCL20的过表达，进而增加乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移，说明脂肪细胞与CCL20共同参与了乳腺癌细胞的转移。

4 小结与展望

CCL20在乳腺癌微环境中发挥重要作用，通过与其受体相互作用激活MAPK、ERK、PI3K/Akt或者NF-κB等炎症信号通路，促进下游VEGF等转录因子活化，促进肿瘤发生。另一方面，CCL20通过调节淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞逃逸或者分泌细胞因子共同影响乳腺癌微环境，促进肿瘤的发生发展。目前CCL20及其受体在炎症、组织损伤等病理生理过程中的作用已有深入的研究，但在乳腺癌方面仍处于基础研究阶段，探究CCL20在乳腺癌微环境中的具体调控机制有助于更深入了解乳腺癌的发生发展过程。阻断CCL20的过程可能为乳腺癌治疗提供新的治疗策略，这将成为未来很好的研究方向。