郑艳丽 综述 贺建霞 审校

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)类型，约占NHL的30%，50岁以上更为常见[1]。DLBCL是一组异质性很强的疾病，约60%的患者可用标准一线环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松联合利妥昔单抗(R-CHOP)方案治愈，但仍有30%～40%的患者一线治疗后失败，发展为复发或难治性DLBCL(rrDLBCL)，且预后很差[2]。在R-CHOP治疗后存活下来的耐药亚克隆在复发时会变得更加丰富。早期识别rrDLBCL对于改善整体疾病的预后至关重要。

随着对DLBCL的深入研究，表观遗传对其发生发展的影响日益受到重视。基因检测技术的发展使识别具有表观遗传改变的特定基因的能力迅速增长，相关药物的研发及临床试验的开展也在不断推进。靶向DNA甲基化的药物能够通过重新编码基因表达过程，影响细胞发育、激活机体免疫反应，为DLBCL挽救治疗提供可能。本文将DLBCL中有重要意义的DNA甲基化改变及其靶向治疗的研究进行综述。

1 DNA甲基化对DLBCL的影响

1.1 DNA甲基化的平衡调控

表观遗传修饰是指未涉及基因DNA序列变化而导致基因表达发生改变的遗传模式。DNA甲基化是研究最深入的表观遗传修饰之一，由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)和DNA去甲基化酶共同调控[3]。调控平衡的破坏参与了DLBCL的发生，DNMTs及其调控基因突变或过表达导致启动子甲基化修饰，高甲基化的启动子区岛通过招募转录抑制因子阻断转录，进而导致附近基因(如抑癌基因)表达失控或沉默，而DNA其他区域则呈现低甲基化状态促进原癌基因的表达，进一步影响细胞增殖和凋亡等过程。这体现了人类癌症呈现整体低甲基化及特异区域高甲基化的特征，常提示疾病预后不良。Wedge等[4]将67例原发DLBCL活检组织的整体甲基化水平以及74例患者血浆样本中的循环游离DNA整体甲基化水平与基线临床特征和总生存期相关联，证实无论是哪种样本基因组整体低甲基化与DLBCL患者生存不良均密切相关，是独立不良预后因素，且整体低甲基化与其他基因高甲基化常同时发生。

1.2 DNMTs

DNMTs催化完成DNA甲基化，包括DNMT1和DNMT3两个家族。DNMT1主要负责维持复制过程中或新生甲基化的活性；而DNMT3催化未甲基化DNA使其从头甲基化，在甲基化位点的建立中起关键作用。DNMT3包括两个从头甲基转移酶DNMT3a、DNMT3b和一个调节蛋白DNMT3L。既往研究表明，人类癌症中DNMTs的过表达与不良预后之间存在显著相关性。Amara等[5]应用免疫组织化学方法分析81例DLBCL患者DNMTs表达与临床病理参数的相关性。分析显示DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的过表达率分别为48%、13%和45%，DNMT1和DNMT3b的同时过表达与晚期临床分期和耐药显著相关，生存分析显示DNMT3b过表达与较短的总生存期和无进展生存期显著相关，且是独立的预后因素。以DNMTs为靶点的甲基化抑制剂根据其化学结构可分为核苷和非核苷两大类。核苷类抑制剂是一类以胞嘧啶核苷为原型的衍生物，其作用机制是在体内代谢形成三磷酸脱氧核苷以代替在DNA复制过程中的胞嘧啶，因与DNMTs具有很强的结合力，可竞争性抑制DNMTs活性，阻断甲基化反应。此类药物主要有阿扎胞苷和地西他滨等。非核苷类药物不含胞嘧啶核苷结构，其去甲基化作用在药物临床试验中被发现，作用机制尚不明确。近期多项体外研究显示使用地西他滨处理DLBCL细胞株有明显的上调抑癌基因、抑制细胞增殖、抑制存活率作用[6-7]。Clozel等[8]在临床试验中观察到DLBCL的化疗耐药性与异常的DNA甲基化程序有关，长期暴露于低剂量DNMTs抑制剂可使耐药细胞在体内对阿霉素敏感。更重要的是，12例高危初治的老年DLBCL患者在R-CHOP之后连续使用阿扎胞苷产生了91.7%的临床完全缓解率，这一数据令人鼓舞，但仍需要大样本数据和长期随访进一步验证。综上所述，这些观察结果提示DNMTs，尤其是DNMT1和DNMT3b过表达可能与DLBCL患者的较短生存期和化疗耐药有关，去甲基化治疗或成为改善复发难治患者预后的途径之一。

1.3 TET双加氧酶

在体细胞中，TET双加氧酶家族是催化DNA去甲基化的重要家族，包括TET1、TET2和TET3。TET酶将部分5-甲基胞嘧啶(5-mC)催化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-mC和5-hmC在TET酶的作用下氧化为5-羧基胞嘧啶(5-caC)，5-caC被胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地识别，进行碱基剪切修复，起到主动去甲基化作用。TET基因突变致酶活性降低，导致其催化功能丧失[9]。TET1是一种CpG-DNA结合蛋白，能够启动DNA去甲基化程序，是调节5-hmC正常含量、防止DNA超甲基化所必需的。Cimmino等[10]发现TET1的缺失在体内增强了干细胞的自我更新，并与BCL-2过表达协同驱动小鼠B淋巴细胞增多，首次为TET1作为造血系统恶性肿瘤，尤其是B细胞淋巴瘤的肿瘤抑制因子提供了体内证据。TET2基因位于4q24.1区域，其突变存在于多种血液系统肿瘤中，以慢性粒单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病最为常见，仅在2%的B细胞淋巴瘤中观察到其突变[11]。TET2和TET3基因调节DLBCL的去甲基化，其甲基化缺失与激活诱导脱氨酶介导的B细胞受体信号通路突变以及G-四联体和R-环的聚集减少有关，导致生发中心来源的B细胞淋巴瘤的自发发展[12]。目前尚无大规模临床数据表明TET突变和缺失与DLBCL的更高发生风险以及更短的无进展生存期有关。但在López-Moyado等[13]的研究中将TET缺陷的不同类型细胞如前体B细胞、T细胞和造血干细胞等与癌症基因组的DNA甲基化模式相比，证明前者同样有局部高甲基化和广泛低甲基化的表观遗传模式。进一步探索TET酶的作用对拓展DNA去甲基化的认识及寻找淋巴瘤治疗新靶点具有潜在意义。

1.4 PCDH10甲基化

PCDH10基因位于4q28.3，其编码的PCDH10蛋白属于非聚集原钙黏蛋白家族δ2型，是一种钙黏蛋白相关的跨膜蛋白，广泛表达于成人和胎儿组织中，在细胞连接、细胞迁移和轴向引导等方面发挥重要作用。PCDH10在肿瘤发生发展中发挥抑癌基因作用，可以通过调控PCDH10-DEPDC1-Caspase轴激活Caspase凋亡信号通路促进肿瘤细胞凋亡。在多种类型NHL中发现高频PCDH10基因启动子高甲基化事件，且其高甲基化会导致NHL细胞对阿霉素耐药性增强[14]。Ying等[15]在80%的DLBCL标本中发现PCDH10启动子高甲基化导致的基因沉默或表达降低，而在正常淋巴结中未发现，提示PCDH10的表观遗传变异在DLBCL的发生中起重要作用。对TP53通路的研究显示，PCDH10是TP53基因的新型转录靶点。p53蛋白通过结合PCDH10启动子区域的共同结合位点来激活PCDH10的表达，进而调节肿瘤细胞的迁移。野生型TP53可以诱导PCDH10的表达，而突变型TP53不能诱导PCDH10的表达[16]。为进一步证实PCDH10甲基化在DLBCL中的意义，Huang等[17]提取了107例DLBCL患者基因组DNA进行检测。其中检测到高达54.2%(58/107)的PCDH10启动子甲基化比率。生存分析显示甲基化患者总生存期和无进展生存期均较未甲基化患者缩短。近期国内一项DLBCL组织与炎性增生组织PCDH10甲基化情况对比研究显示，DLBCL组织甲基化比率(40/55)明显高于炎性增生组织(6/23)，且高甲基化水平与患者高IPI评分、Ann Arbor分期晚有明显相关性(P<0.05)，其细胞实验证实地西他滨能逆转PCDH10的高甲基化、促进DLBCL细胞的凋亡，说明PCDH10甲基化状态可以作为一个有价值的预后指标，有望成为表观遗传治疗药物的潜在靶点[18]。

2 DNA甲基化的靶向治疗

DLBCL对标准免疫化疗的耐药性是一个尚未解决的难题。去甲基化不仅通过各种途径影响肿瘤DNA，也可起到化疗和免疫疗法增敏的作用[19-20]。目前临床上已开始尝试利用靶向异常DNA甲基化来治疗某些肿瘤。针对活化B细胞型DLBCL患者，在R-CHOP的基础上追加新的靶向药物已经经历了非常多的尝试，其中三项较大的全球多中心临床试验(PHOENIX、REMoDL-B、ROBUST)研究均宣告失败，提示活化B细胞型DLBCL患者仍然具有很高的异质性。Wright教授团队从分子机制的角度将DLBCL分成了7类(MCD、BN2、N1、EZB-MYC+、EZB-MYC-、ST2、A53)，进一步揭示了DLBCL的异质性，提示制定个体化靶向治疗方案的重要性[21]。相关研究显示，突变型TP53与EZH2相互作用会增强其与染色质的关联，增加调节细胞自我更新和分化基因的H3K27三甲基化水平，药物抑制EZH2会降低TP53突变DLBCL细胞的再生潜力[22]。赵维莅教授团队在第16届国际淋巴瘤大会上公布了其基于分子分型的DLBCL R-CHOP+X临床对照研究(Guidance-01)的初步成果。其研究纳入128例初发的中/高危DLBCL患者，基于分子分型的结果给予不同的靶向联合治疗方案。结果显示TP53突变/缺失亚型患者联合使用地西他滨的完全缓解率显著高于R-CHOP组(82%vs.60%)，而副作用没有显著增加。目前地西他滨单药治疗rrDLBCL的Ⅳ期临床试验也正在进行(NCT03579082)。上述研究均显示出去甲基化药物的治疗潜力，有望推动DLBCL进入精准分子治疗时代。

3 小结与展望

更好地理解淋巴瘤的表观遗传改变提高了对淋巴瘤发病机制和疾病进展的认识。DNA甲基化是高度可变的过程，主要通过沉默肿瘤抑制基因起作用，多种靶向药物可以逆转异常的表观遗传修饰进而改善疾病预后。去甲基化药物在治疗骨髓异常增生综合征及髓系白血病等血液系统疾病方面取得了较好的疗效，大量临床前数据表明地西他滨对淋巴系统恶性肿瘤也有明显的抑制作用，临床研究同样显示地西他滨对rrDLBCL可能具有较好的应用潜力和治疗活性，这为临床医生提供了新的治疗思路。同时，不同类型表观修饰抑制剂联合用于肿瘤治疗的方法也逐渐发展起来，例如5-氮杂胞苷与组蛋白脱乙酰酶伏立诺他联合用于治疗淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期临床试验也在进行(NCT00538876和NCT01120834)。开发新型合理联合治疗手段为DLBCL治疗描绘出更光明的治疗前景。