丁元钧，王 丹,2，颜泽栋，郝晓霞,2，邵 希，罗二平，景 达,3

(空军军医大学：1军事生物医学工程学系军事医学装备与计量学教研室，3陕西省生物电磁检测与智能感知重点实验室，陕西 西安 710032；2西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

力学刺激每时每刻都存在于机体，参与并影响着机体多种正常生理活动。骨组织作为一种特殊的生物力学材料，基于其力学敏感性，能够通过改变骨量、骨组织内部排列结构和机械特性的方式适应并抵抗外界的力学载荷刺激，从而达到最优的状态[1]。

机械应力刺激有多种方式，包括压缩应力、拉伸应力、流体剪切力等[2-3]。骨细胞在日常生活中均会受到以上三种形式的应力刺激，其中拉伸应力是骨细胞承受的一种重要的生理性应力刺激，例如运动状况下骨骼和肌肉的反复拉伸[4]，口颌系统咀嚼运动时牙周膜组织承受的规律牵张[5]等，诸如此类有“节奏”的周期性拉伸应力，尽管不易察觉，却是刺激骨组织代谢的重要因素。此外，拉伸应力也被广泛研究在正常和病理性状况下对血管平滑肌细胞[6-7]和内皮细胞[8-9]的影响。由此可见，拉伸应力对细胞和组织的生长发育，尤其对骨组织的形成和功能具有十分重要的作用[10-11]。鉴于体内力学刺激环境的复杂性，要想研究拉伸力作用对细胞的影响，就需要设计一套体外细胞拉伸力加载系统，简化模拟出对细胞施加拉伸力刺激的过程。

因此，本课题组自主设计并构建了一套体外细胞周期拉伸力闭环反馈加载系统，用于对各种类型的细胞施加不同大小和频率的拉伸应变，并对该系统进行了性能测试，从而为后期研究不同细胞在拉伸力作用下的变化及相关分子机制等打好硬件基础。

1 材料与方法

1.1 材料

负压真空表。型号：BPK105；量程范围：-0.1～0.1 MPa；精度：±0.3%；电源电压：220 V AC。它是集压力测量、显示、输出、控制于一体的智能数显压力测控产品，能将测压元件传感器感受到的气体、液体等物理压力参数转变成标准的电信号，以供指示报警仪、记录仪、调节器等二次仪表进行测量、指示和过程调节。

电磁阀、真空阀。型号：VT307-5G，是一种两位三通阀；使用压力范围：-0.1～0.9 MPa；响应时间：<20 ms；最高动作频率：10次/s。作为执行器，具有很高的控制精度和灵敏度，能有效调整介质的方向、流量等。

真空泵。型号：WK-1N1C。整体式缸体结构，拥有高精密度及高真空度；强制油泵润滑，确保高可靠性；采用防返流设计。

1.2 方法

1.2.1 体外细胞周期拉伸力加载系统的设计与研制

1.2.1.1 拉伸力加载系统整体结构图 使用AutoCAD软件设计的加载系统整体结构见图1，整个系统主要由底座、配电箱、真空泵和气罐四大部分组成。底座相当于基板，其上有四个细胞培养六孔板，每个六孔板被安置在固定座上并用密封框密封以防漏气。每个孔内为Ⅰ型胶原涂层的柔性硅胶薄膜，细胞被培养在膜上。每个膜下方均有一个直径为25 mm的圆形加载柱，实际加载时，需要在膜与加载柱之间涂抹硅基润滑油从而减小摩擦带来的干扰。从图1可以看出，四个六孔板下方均有一个吸气孔，吸气孔与软管相连后连接至真空阀，真空阀再连接至气罐，而气罐又通过电磁阀与真空泵相连。当装置处于工作状态时，真空泵通过气罐将六孔板与底座间腔室内的气体吸出，从而使加载柱周围的膜被吸附下来，并使得在膜上培养的细胞受到拉伸应变。此外，在每个吸气孔和真空阀之间还设有球阀，它可以使四个六孔板同时工作，也可只控制其中一个或某几个运行，但总有一个六孔板处于工作状态。

图1 加载系统整体结构图

1.2.1.2 拉伸力加载系统配电箱布局图 拉伸力加载系统配电箱模块布局见图2。在配电箱的面板上包含报警灯、电源灯、泵运行灯这三个状态指示灯以及泵开关、加载开关、报警开关这三个开关旋钮。此外，配电箱模块中还包含真空阀、电磁阀这两个控制阀以及两种继电器和三块真空表。其中泵开关用于启动真空泵抽真空，使气罐内处于负压状态；加载开关用于打开真空阀，使通路连通，将腔室内的气体吸出；报警灯用于指示，当装置在运行过程中出现真空泵故障、六孔板固定不到位或是由于连接处气密性不好导致漏气时就会报警；泵压控制真空表本质上是一个减压阀，通过设置可使腔室内的压力减少设定的值(百分比形式)，从而调节施加的应变值大小；腔室压力显示真空表用来实时监测黑色橡胶底板上腔室内的工作压力；气罐压力显示真空表则用来实时监控蓝色气罐内的压力，在启动抽真空阶段通过预设的上下限压力值可控制真空泵工作或停止。此外，它也可以作为一个报警表，当监测到气罐内压力值异常时会触发报警。

图2 加载系统配电箱模块布局图

1.2.1.3 拉伸力加载系统的实物图 体外细胞周期拉伸力加载系统实物图见图3。

图3 加载系统实物图

1.2.2 体外细胞周期拉伸力加载系统的操作流程及工作原理 整个加载系统内部由STC89C52单片机进行电路控制。在使用加载系统前，首先连接好管道，检查橡胶管与六孔板之间的连接是否紧密，在确保整个系统气密性状态良好后，插上电源，此时配电箱模块中的电源指示灯和三块真空表变亮。接着顺时针旋转90°打开泵开关(此时电磁阀随之开启)，启动真空泵抽真空，并通过减压阀设置实验所需压力值大小。待泵运行稳定后再打开加载开关，此时真空阀线圈得电，负压气罐和腔室之间的连接通路被打开，腔室内的空气由于压强原因会向气罐流动，使腔室内形成负压环境，从而将加载柱周围的弹性膜吸附下来，最终使膜上培养的细胞受到双轴拉伸应变。减压阀设置的负压值越大，膜片向下的变形程度就越大。当腔室内的压力减少预设值后，腔室压力显示真空表会输出一个开关量关闭真空阀，同时启动单片机的内部定时器使膜片在拉伸变形状态下持续5 s。5 s后，真空阀线圈再次得电并打开腔室和大气之间的连接通路，大气进入腔室内，膜片慢慢回弹，当腔室内的压力回升到一定值后，膜片恢复至未变形状态。此时单片机又会收到负压表的输出信号，从而关闭真空阀并再次启动内部定时器使膜片在未变形状态下持续5 s。5 s后真空阀再次打开，如此循环往复，通过控制真空阀的开启和关闭、转换真空阀内的连接通路，最终将频率为0.1 Hz(周期为10 s)的动态循环拉伸应力施加到柔性硅胶膜上。实验结束后关闭仪器时，采用逆序的顺序，先逆时针旋转90°关闭加载开关，当加载腔室压力恢复至大气压或膜片不再动作时，再关闭泵开关。

1.2.3 体外细胞周期拉伸力加载系统的工作性能测试

1.2.3.1 膜应变线性测试 选择六孔板内任意一个孔，在孔中感兴趣区内(即加载柱区域)标记一条线段(图4)。通过调节减压阀，对膜片依次施加30%、40%、50%、60%和70%设定值所对应的梯度拉伸应力(应力太小时膜应变细微，不易测量；太大时被认为不具有生理学意义，故选择此范围)。将相机放置在一个定制的水平台上，使镜头通过台板上的圆孔对准下方已做好标记的硅胶膜。分别采集孔内不同应力加载下膜拉伸形变前后的图像并使用ImageJ软件测量形变前后线段的长度(均选用直径为25 mm的圆形加载柱作为标尺)，根据长度伸长量便可计算出不同应力加载下的膜应变值，进而分析减压阀设定值和膜应变值这两个因素之间是否存在线性相关关系。

图4 加载柱内线段标记图

当膜片处于吸附状态时开始拍照。由于系统的加载周期为10 s，所以在每一轮应力加载时，均采用连拍模式一次性采集100张图片(10张/s)。采集结束后，从第10张图片开始，每隔10张选取1张，每组共选择10张图片(5张形变，5张未形变)，分别测量每张图片中线段的长度并计算形变和未形变两种状态下线段长度的平均值。此外，每当更改减压阀设定值后，先让系统循环加载5～10轮，待腔室内压力减小设定值后再进行图像采集。

1.2.3.2 膜应变各向同性测试 为了验证拉伸应变是否具有各向同性，我们在膜上感兴趣区内标记了两组彼此正交的长度不一的线段(图5)：第一组线段的方向为横向和纵向，第二组线段的方向为45°和135°方向。依次设置减压阀梯度输出值为30%～70%，采用相同方法进行图像采集分析。在每一个加载应力下，计算比较四个方向上的膜应变值，从而对各向同性进行判断。此外，在每一个方向上，相当于又进行了一次1.2.3.1中的实验，因而可进一步验证膜应变的线性。

图5 加载柱内四个不同方向上的线段标记图

1.2.3.3 膜的顺应性测试 为了测试膜的顺应性程度，即膜应变随加载时间延长、循环加载次数增加时的一致性，采用1.2.3.1中标记的线段，分别设置减压阀输出值为30%和60%，而后对硅胶膜施加连续2 h的循环拉伸应力，并在每隔20 min时采一次图(每隔20 min相当于增加了120次循环应力加载)。依次测量计算出20、40、60、80、100、120 min时的膜应变值，从而对两种应力加载下的膜顺应性进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 膜应变线性测试结果

对减压阀设定值和膜应变值进行线性回归分析，结果显示，随着减压阀设定值的梯度增加，拉伸后的线段长度以及膜应变值均呈线性增加的趋势，膜应变均值从30%输出时的4.05%增加至70%输出时的7.35%(图6)。减压阀设定值与膜应变值之间的关系为：膜应变值(%)=0.082 43×减压阀设定值(%)+1.663，二者的拟合程度较高(R2=0.993 9)，线性关系较好。当减压阀设定值每增加10%时，膜应变值平均增加0.82%。

图6 不同减压阀设定值下的膜应变值

2.2 膜应变各向同性测试结果

测量分析四个方向(横向、纵向、45°、135°)上膜应变的线性程度，结果显示，无论在哪一个方向上，膜应变值均随减压阀设定值的递增而线性增加(图7)。线性拟合结果显示，四个方向上的R2值均大于0.99，表明减压阀设定值和膜应变值之间均存在显著的线性相关关系。其中，在45°方向上时，R2=0.997 0，表明在本次实验中，该方向上膜应变值的线性程度最高。通过这四组数据，进一步验证了该牵张力加载系统在弹力膜上加载柱区域内具有膜应变线性的特征，表明本系统具有一定的可靠性。

图7 不同减压阀设定值下各个方向上的膜应变值

接下来比较同一应力加载下加载柱内不同方向上的膜应变值是否一致。从表1可以看出，无论减压阀设定值是多少，各个方向上膜应变值之间的差异较小，并未在某个方向上出现偏差较大的异常值。膜应变差值的最大值出现在30%减压阀设定值处，差值为0.34%，并且随着减压阀设定值的增加，差值不断减小，这可能是由于施加应力较小时，膜的某些方向还未被完全拉伸所致。

表1 不同减压阀设定值下各个方向上的膜应变值

2.3 膜的顺应性测试结果

从表2可以看出，在30%和60%减压阀设定值下，随着加载时间的延长，膜应变值(净增加量)整体呈现出缓慢增加的趋势，说明当循环加载周期数增加时，硅胶膜的顺应性略有增加，杨氏模量略有减少。此外，60%减压阀设定值时的膜应变增长趋势比30%时明显：在30%减压阀设定值下，膜应变最小值为4.07%，最大值为4.20%，两者相差0.13%，用差值除以最小值得到的标准化后的值为0.031 9；而在60%减压阀设定值下，膜应变最小值为6.68%，最大值为6.91%，两者相差0.23%，标准化后的值为0.034 4，比30%减压阀设定值时稍大，说明施加的加载应力越大，硅胶膜越容易屈服于拉伸应力，顺应性增加也相对明显，但短时间内不具有统计学意义。

表2 30%和60%减压阀设定值下不同时间点的膜应变值

3 讨论

骨组织能够支撑机体并承担外界的应力载荷。根据外界力学刺激的不同，骨组织能适应外界应力载荷的改变，并进行可塑性改建。机械牵张应力作为一种重要的应力刺激模式，在临床上已被广泛应用于牵张成骨和口腔正畸[12-13]，正常骨组织的生长吸收改建、新骨形成、骨折后的骨痂修复等都与生理或者外加的拉伸力刺激密切相关[14-15]。

为了分析在特定条件下拉伸载荷引起的细胞变形力学传递过程，目前已有的相关装置主要分为两类：第一类是单轴牵张力加载装置，例如三点、四点弯曲加载装置；第二类是双轴牵张力加载装置，又分为平面外圆形基质牵张装置和平面内圆形基质牵张装置。其中平面内圆形基质牵张装置由于与弹性膜接触的基底是圆形的，保证了弹性膜在各个方向受力的均匀性，避免了不同位置受力不一致的情况，因此在实际中应用更多。基于此类装置的工作原理，本课题组自主设计了一套体外机械牵张应力闭环反馈加载系统，系统通过真空吸附柔性硅胶膜的方式，将膜拉过选定直径的圆形加载柱，使加载柱周围的膜产生形变，并最终将双轴拉伸应变作用于膜上附着的细胞。通过改变减压阀和系统内部定时器的设定值，还可以改变施加拉伸应力的大小和频率。

为了进一步验证该牵张力加载系统的科学性和准确性，我们对装置进行了性能测试。在膜应变线性测试中，尽管COLOMBO等[16]在进行硅胶膜破坏性实验时发现，当施加的应力使硅胶膜的应变值超过150%快接近破裂时，硅胶膜会表现出一个非线性区域，但是当硅胶膜的应变值处于常见的正常范围内时，可以认为膜应变值与施加的应力值之间存在线性相关关系[16]。我们的测试结果也证明确实如此。此外，多数实验施加的膜应变值范围在0.7%～20.0%之间[16-17]，而我们实验中选择的膜应变值范围为4.0%～7.5%，这些值均远小于非线性状态下的起始值。其次，在内环境中，细胞膜以及细胞本身受到的应变值均不可能达到这么高的水平，高应变环境会对细胞本身的生理活性产生很大的负面影响，所以应变值较大时也不具备生理学意义。因而可以认为我们装置施加的膜应变值满足线性要求。

在膜应变各向同性测试中，虽然同一减压阀设定值下各个方向之间的膜应变值略有差异，但是我们仍然认为该装置施加的膜应变满足各向同性。BIELER等[17]使用高精度应变分析软件DIC对膜进行应变分布测量时发现，最大测量误差范围为0.10%～0.17%，且最终测得的感兴趣区内的应变值也有±0.10%的波动，相当于最大差值为0.20%，但作者仍然认为膜上各处的应变值分布是均匀的。并且后续实际进行细胞实验时，施加的应变值间隔最小往往也不低于1%，所以可以忽略这些差值带来的影响。因而可以认为装置施加的膜应变值在各个方向上是近似相等的。

在膜的顺应性测试中，我们发现随着加载时间的增长，膜顺应性会略微增加，这与BIELER等[17]动态加载时对膜顺应性的测量结果保持一致。分析膜顺应性增加可能有以下三个原因：第一是由于膜片材料本身由于长时间反复拉伸发生了塑性形变；第二是由于硅胶膜与加载柱之间润滑脂中的溶剂会随着反复牵张而蒸发，从而使摩擦力发生改变，对膜应变值产生影响；第三是由于当加载应变幅值较大时，膜粘弹性效应的影响可能会加剧。需要说明的是：当装置加载时间不长时，可以忽略顺应性带来的影响，此时可以认为装置施加的膜应变值具有可重复性。但是当装置持续循环加载较长时间后，最好考虑顺应性带来的影响，可以定期更换六孔板，或者在加载中每隔固定时间(如24 h)便对装置重新进行标定，通过建立新的拟合公式以适应长期加载时膜应变值的变化，从而使结果更具合理性。

综上所述，我们自主设计的体外细胞周期拉伸力闭环反馈加载系统能够在加载柱内施加精确可控的、满足线性、各向同性且可重复的拉伸膜应变，具有科学性和可靠性，为后续研究拉伸力作用下的细胞生物学效应提供了良好的硬件平台支撑。