赵丽娜 朱洪坤 吴欣航 张爽 范文忠 崔娟

(吉林农业科技学院，吉林省·吉林市，132101)

君子兰(Cliviaminiata)属于石蒜科(Amaryllidaceae)君子兰属(Clivia)多年生草本植物，花、叶子和果实都具有很高的观赏价值[1]。君子兰在世界各地广为栽培，是全球最重要的观赏花卉之一，备受人们的喜爱。然而君子兰在养殖的过程中常易发生病害，例如炭疽病、白绢病、叶斑病、软腐病、灰斑病、黄叶病等都是比较常见的主要病害[2]。2019年夏，在吉林农业科技学院温室大棚中发现一种君子兰新病害——叶枯病，其发病率为25%～60%。发病部位主要为中下部叶片，从叶片边缘开始变褐，然后逐渐枯萎扩大，发病较重，严重影响君子兰的生长与观赏。该病害在我国属首次发现，未见系统报道和相关研究。为明确君子兰叶枯病的病原归属，本文对该病原菌进行分离纯化、致病性测定，根据病原细菌的表型特征和分子鉴定，明确引起君子兰叶枯病的病原种类；并通过对君子兰叶枯病的药剂筛选研究，为该病害的防治提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

供试植物：君子兰正常植株和病株均来源于吉林农业科技学院温室大棚。

供试NA液体培养基：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g，加入蒸馏水定容至1 L，调pH7.0～7.2；NA固体培养基，在上述配方的基础上加入15 g琼脂。以上2种培养基均于121 ℃灭菌20 min后用于病原菌的分离、纯化及培养。

供试药剂：20%噻菌铜悬浮剂，浙江龙湾化工有限公司；30%乙蒜素乳油，河南中威春雨植物营养有限公司；0.3%四霉素水剂，辽宁微科生物工程股份有限公司；3%中生菌素可湿性粉剂，华北制药河北华诺有限公司；40%三氯异氰尿酸可湿性粉剂，湖南神隆海洋生物工程有限公司；70%碱式硫酸铜水分散粒剂，海利尔药业集团股份有限公司；46%氢氧化铜水分散粒剂，美国杜邦公司；85%波尔·甲霜灵可湿性粉剂、77%硫酸铜钙可湿性粉剂，江苏龙灯化学有限公司；6%春雷霉素，山东利邦农化有限公司。

1.1 试验方法

病害症状观察。2019年夏在吉林农业科技学院温室大棚中，采集具有君子兰叶枯病典型症状的患病叶片，观察并记录病害症状。

病原菌的分离与纯化。选取发病部位的叶片，按照方中达[3]方法进行病原菌的分离。剪取叶片病健交界处，用体积分数75%乙醇消毒30～60 s，然后用无菌水冲洗3次，放入灭菌的培养皿内并将病组织剪碎，加入少量的无菌水，静止10 min，制成菌悬液。用接种环蘸取菌悬液在NA培养基上划线，然后将平板置于相对湿度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒温培养箱中28 ℃培养24～48 h，长出单菌落后用接菌环挑取性状一致的优势菌落进行纯化，纯化后的菌株用80%甘油于-80 ℃条件下保存备用。

致病性测定。依据柯赫氏法则[4]进行致病性测定。在5 mL的NA液体培养基中加入代表性菌株单菌落，并于28 ℃、180 r/min振荡培养12 h，加入适量无菌水配成体积为1×108CFU/mL的细菌悬浮液，备用。叶片采用针刺喷雾法，在喷雾前，君子兰叶片采用75%乙醇进行表面擦拭消毒，然后用无菌针将君子兰叶片造成微伤口，取0.5 mL菌悬液喷到叶片上，重复3次，用等量的无菌水作对照，接种完成后28 ℃保湿培养，3 d后开始观察发病情况。如果从接种发病的叶片上分离出相同的病原菌，则证明该菌株具有致病性。

病原菌菌落形态、生理生化试验。取代表性菌株在NA培养基中划线后于相对湿度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒温培养箱中28 ℃倒置培养24 h，长出菌落后观察菌落特征，主要包括形状、颜色、大小、光泽、表面状况、边缘、透光性、隆起度以及是否产生色素等。菌株部分生理生化试验具体方法按照方中达等常规方法[3，5-6]进行。

病原菌分子鉴定。采用细菌16S rDNA的通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增[7]。扩增体系为25 μL：PCR Master Mix 2×12.5 μL，DNA模板100 mg·L-11 μL，上游和下游引物均为10 mmol·L-1各0.5 μL，最后用ddH2O补足至25 μL。

PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并送到上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与GenBank数据库中标准菌株的序列进行BLAST比对，确定其分类地位。选择高相似性序列，用MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining[8]法生成系统发育树，MEGA 7.0软件的使用方法与MEGA 4.0相同[9]。

病原菌对药剂的敏感性。本试验采用抑菌圈法，将代表性菌株制成体积为1×106CFU/mL的菌悬液，NA液体培养基冷却到45～50 ℃时，将菌悬液按照体积比1∶20的比例加入其中，混匀后再倒入已灭菌的培养皿中，待冷却凝固。用无菌镊子分别夹取3片单层无菌滤纸片(直径为6 mm)以等边三角形的排列方式放入到已凝固的含菌NA固体培养基中。将不同药剂配置成5个质量浓度，20%噻菌铜悬浮剂：200、400、600、800、1 000 mg·L-1；30%乙蒜素乳油：200、400、600、800、1 000 mg·L-1；0.3%四霉素水剂：1 500、2 500、4 000、5 000、10 000 mg·L-1；3%中生菌素可湿性粉剂：1 000、2 000、2 500、4 000、5 000 mg·L-1；46%氢氧化铜水分散粒剂：2 500、5 000、6 000、10 000、20 000 mg·L-1；其他药剂：1 000、2 500、5 000、7 500、10 000 mg·L-1。用移液枪分别移取10 μL不同质量浓度的药液滴加到滤纸片上，每种药剂3次重复。滴加10 μL无菌水的滤纸片为对照，然后将培养皿放入相对湿度65%、12 h光照/12 h黑暗、恒温培养箱中28 ℃培养1 d，用十字交叉法测量各处理的抑菌圈直径，计算抑菌率。以药剂质量浓度数值为自变量x，抑菌率的概率值为因变量y，建立毒力回归方程，通过毒力回归方程计算各药剂半致死质量浓度[10-11]。

抑菌率=[(处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/处理抑菌圈直径]×100%。

1.2 数据分析

试验所得数据利用DPS(v14.1)软件进行毒力回归方程数据分析，建立毒力回归方程，并求出各药剂的半致死质量浓度及相关系数r，比较不同药剂的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 田间病害症状

君子兰叶枯病主要症状为：从叶片边缘开始变褐，然后逐渐枯萎扩大，发病部位主要为中下部叶片，严重时发病率可达60%，影响植物的生长与观赏(图1)。

A.发病初期；B.发病后期。图1 君子兰发病叶片

2.2 致病性

采用平板划线分离法对新鲜病组织进行分离和纯化后共获得培养性状一致的10株菌株，分别编号为JZL01～JZL10，本试验选取了代表性菌株JZL01进行了致病性测定。结果表明，接种后第7天，接种的君子兰叶片明显变褐色(图2A)；接种后第14天，病斑颜色转为深褐色，并逐渐枯萎扩大(图2B)，发病症状与田间症状基本一致；而对照植株未观察到发病症状(图2C～D)。对接种发病部位进行病原菌再分离，经形态观察及分子序列分析证实与原接种菌株一致。

A.接种JZL01菌株7 d后的症状;B.接种JZL01菌株14 d后的症状;C.接种无菌水7 d后的症状;D.接种无菌水14 d后的症状。图2 分离菌株对君子兰离体叶片的致病性测定

2.3 病原菌的特征

菌落形态：在NA培养基上生长24～48 h后，菌株形成白色半透明的菌落(图3)，表面粗糙，扁干，边缘不规则，最适培养温度为28 ℃。生理生化结果见表1，分离菌株的生理生化试验结果与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)特征基本一致。

2.4 分子生物学鉴定

经形态学测定和16S rDNA序列比对鉴定，菌株JZL01～JZL10为同一菌株。基于16S rDNA基因序列，构建菌株JZL01和相关参比菌株的系统发育树(图4)，菌株JZL01与B.cereus菌株MN746166同在一个系统发育分支上，菌株JZL01与上述菌株16S rDNA序列相似性为100%。根据上述对JZL01菌株的生理生化鉴定、菌的形态特征以及16S rDNA序列同源性分析结果，将分离得到的菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。

A.正面;B.背面。图3 君子兰叶枯病分离菌株的形态特征

表1 君子兰叶枯病分离菌株生理生化测定结果

2.5 病原菌对药剂的敏感性

在10种药剂中，20%噻菌铜悬浮剂和30%乙蒜素乳油对菌株JZL01的半致死质量浓度最小，分别为715.30和941.96 mg·L-1；0.3%四霉素水剂、3%中生菌素可湿性粉剂、40%三氯异氰尿酸可湿性粉剂和70%碱式硫酸铜水分散粒剂对菌株JZL01的半致死质量浓度较小，分别为1 716.33、2 103.18、2 227.82和2 855.10 mg·L-1；46%氢氧化铜水分散粒剂、85%波尔·甲霜灵可湿性粉剂、6%春雷霉素水剂和77%硫酸铜钙可湿性粉剂对菌株JZL01的半致死质量浓度最大，分别为4 913.33、5 693.91、9 905.99和10 684.33 mg·L-1(表2)，表明20%噻菌铜悬浮剂和30%乙蒜素乳油可作为防控该病害的首选药剂(图5)。

图4 基于16S rDNA基因序列构建的JZL01菌株系统发育树

A～E.药剂对病原菌的抑菌效果;F.对照。图5 病原菌对药剂的敏感性试验

表2 供试药剂对Bacillus cereus的室内毒力测定

3 结论与讨论

本研究首次报道了在吉林农业科技学院温室大棚中发现君子兰叶枯病，该病害是在君子兰上新发现的一种细菌性病害，经生理生化特性分析和16S rDNA鉴定，该病病原菌为蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。

有研究表明，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)能引起梨树花芽和叶片枯萎[12]，引起芒果叶枯病[13]，影响生姜生长[14]；环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)能使椰枣幼苗致病[15]；巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)能引起小麦白斑病[16]；蜡样芽孢杆菌能感染黄瓜、大蒜、辣椒、马铃薯等蔬菜[17-18]，感染蓝莓引起蓝莓叶枯病[19]，但还未见蜡样芽孢杆菌感染君子兰的报道。

目前用于细菌病害防治的药剂较少，多数采用铜制剂或者抗生素对病害进行防治[20]。本研究选用了10种药剂进行君子兰叶枯病病原菌的药剂敏感性测试，其中该病原菌对20%噻菌铜悬浮剂和30%乙蒜素乳油的敏感性较高，有望作为君子兰叶枯病的田间防治药剂，但田间防治效果还有待进一步验证。